針刺對(duì)糖尿病大鼠下丘腦lepinr蛋白及其mrna表達(dá)的影響

針刺對(duì)糖尿病大鼠下丘腦lepinr蛋白及其mrna表達(dá)的影響

當(dāng)人們首先發(fā)現(xiàn)受體時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)的主要功能是減少食欲、消耗和降低體重。與leptin反應(yīng)（leptin反應(yīng)，受體為素受體）相結(jié)合。LeptinR在下丘腦的多個(gè)核團(tuán)表達(dá)。糖尿病狀態(tài)攝食、能量平衡和體重均發(fā)生改變,而針刺對(duì)這些癥狀有不同程度的改善。針刺的這種效應(yīng)是否存在與LeptinR相關(guān)的中樞機(jī)制?為觀測(cè)針刺對(duì)下丘腦LeptinRmRNA表達(dá)的影響,探討針刺對(duì)糖尿病內(nèi)分泌調(diào)控的中樞機(jī)制,我們進(jìn)行了以下研究。1材料和方法1.1stz溶液的配制選擇體重為180~220gWistar大鼠30只,大鼠禁食12h后,左下腹腔內(nèi)注射鏈脲左菌素(streptozotocin)(用pH值為4.2的0.1mol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液,在冰浴中新鮮配制10mg/mL的STZ溶液),劑量為50mg/kg體重。72h后開始測(cè)血糖,凡血糖水平在16.7mmol/L以上者列為糖尿病造模成功。隨即進(jìn)行分組和治療。1.2關(guān)元、后實(shí)踐及記錄正常對(duì)照組13只。造模成功的DM大鼠隨機(jī)分為兩組,即模型組,針刺治療組:取“關(guān)元”、雙側(cè)“后三里”、“胰俞”,(參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜》),“關(guān)元”用普通28號(hào)1寸不銹鋼毫針刺向上斜刺0.2~0.3mm,“后三里”、“胰俞”用普通28號(hào)1寸不銹鋼毫針針刺,接G6805-2型電針治療儀(雙側(cè)“后三里”為一對(duì)電極,雙側(cè)“胰俞”一對(duì)電極);選連續(xù)波,頻率100Hz,強(qiáng)度以大鼠肢體輕微抖動(dòng)為度,留針15min。進(jìn)行2個(gè)療程的治療,每個(gè)療程6天,療程間隔2天。記錄各組飲食、飲水及體重。造模及治療過程中,模型組因高血糖等原因死亡4只,針刺治療組死亡3只,取材時(shí)治療組溶血樣本1例,故模型組和針刺治療組檢測(cè)樣本各11例。1.3指標(biāo)和方法的檢測(cè)1.3.1血液中的葡萄糖由美國生命公司生產(chǎn)的susepe血液中的糖計(jì)及其支撐體測(cè)試1.3.2連續(xù)冠狀切片動(dòng)物經(jīng)10%水合氯醛腹腔麻醉后(0.3mL/100g)開胸,4℃4%多聚甲醛灌注固定后取腦,后固定過夜,切取視交叉至乳頭體后部平面腦段運(yùn)用振動(dòng)切片機(jī)行連續(xù)冠狀切片,片厚30μm。切片分2套,一套備用。運(yùn)用免疫組化SABC法,免疫組化試劑盒購自Boster公司。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。1.3.3藥物處理和轉(zhuǎn)染原位雜交檢測(cè)試劑盒購自Boster公司,采用LeptinR寡核苷酸探針,經(jīng)地高辛標(biāo)記。上述備用組織切片一套,經(jīng)預(yù)雜交處理后,按要求在每張切片上加20μLNPY寡核苷酸探針雜交液,42℃恒溫箱雜交過夜;洗滌后滴加生物素化鼠抗地高辛;葡萄糖氧化酶-DAB法顯色。陰性對(duì)照結(jié)果呈陰性。1.4leptinr陽性神經(jīng)元/陽性反應(yīng)物的檢測(cè)采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖象分析。每鼠取腦片5張,400倍鏡下檢測(cè)各片下丘腦PVN、ARC部位LeptinR陽性神經(jīng)元的平均吸光度(OD,opticaldensity)、LH部位LeptinRmRNA陽性反應(yīng)物的OD值及總面積(stainarea)。每片于每側(cè)相應(yīng)部位取2個(gè)視野,分別測(cè)定,累加取均值,即為該鼠OD值和面積值。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-WayANOVA),顯著水平設(shè)為0.05。2結(jié)果2.1leptinr免疫陽性物情況STZ糖尿病大鼠血糖升高,表現(xiàn)出明顯的多飲、多食和消瘦,針刺治療后血糖水平降低,進(jìn)食、飲水減少,體重減輕得到改善,與糖尿病組比較,均有顯著性差異(P<0.05)。見表2。LeptinR免疫陽性物呈深棕色,分布于細(xì)胞膜上,細(xì)胞核及胞漿均不著色。腦片以下區(qū)域,如下丘腦、皮質(zhì)、海馬等部位均有陽性免疫物的分布。糖尿病大鼠(B組)下丘腦PVN、ARC部位LeptinR免疫陽性物平均吸光度值較正常大鼠明顯減少(P<0.05),表明糖尿病大鼠下丘腦PVN和ARC部位LeptinR蛋白表達(dá)明顯減少。針刺后,下丘腦PVN和ARC的平均吸光度較糖尿病組明顯上升(P<0.05),表明針刺可以增加糖尿病減少的LeptinR蛋白含量。2.3tinrmna的表達(dá)原位雜交的結(jié)果顯示,LeptinRmRNA的細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色。正常大鼠各腦片均可見下丘腦外側(cè)區(qū)棕黃色LeptinRmRNA的表達(dá),其余腦區(qū)未見表達(dá)。造模后,LH部位LeptinRmRNA陽性物平均吸光度、面積較正常組明顯減少(P<0.05),表明STZ糖尿病大鼠LH部位LeptinRmR-NA表達(dá)明顯減少,針刺治療組大鼠LH平均吸光度、陽性面積較模型組明顯增加,提示針刺可使減少的LeptinRmR-NA表達(dá)增多(P<0.05)。3討論3.1leptinr基因表達(dá)的結(jié)構(gòu)及意義本研究顯示,LeptinR陽性神經(jīng)元在下丘腦室旁核、弓狀核及下丘腦外側(cè)區(qū)分布較多。而原位雜交的結(jié)果提示,LeptinRmRNA僅存在于下丘腦外側(cè)區(qū),提示LeptinR主要在下丘腦外側(cè)區(qū)產(chǎn)生。下丘腦是LeptinR最主要存在的部位之一,這和前人的研究相同。以往報(bào)道,LeptinR廣泛存在于大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng),包括下丘腦、杏仁核等與味覺和攝食調(diào)節(jié)密切相關(guān)的核團(tuán)。應(yīng)用原位雜交技術(shù),在下丘腦的主要核團(tuán),如弓狀核、腹外側(cè)核、視上核等均檢測(cè)到了LeptinRmRNA。本研究采用多相寡核苷酸探針和高敏感標(biāo)記技術(shù),并配合使用敏感性加強(qiáng)型的原位檢測(cè)方法,具有敏感性特別高,背景清晰,結(jié)果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)。但在LeptinRmRNA表達(dá)的具體核團(tuán)方面與以往研究存在差異,可能由于試劑來源不同造成。瘦素受體(LeptinR或OB-R)屬于細(xì)胞因子Ⅰ類受體家族,具有獨(dú)特的一級(jí)結(jié)構(gòu),其二級(jí)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞因子相似,由細(xì)胞外結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)三部分組成。LeptinR的主要生理功能是與瘦素結(jié)合,使瘦素發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡、脂肪貯存等生理作用,同時(shí)參與瘦素的自分泌調(diào)節(jié)及其在生殖、造血等方面的作用。20世紀(jì)90年代初期,JAK-STAT轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的發(fā)現(xiàn)使人們?cè)陉U釋細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面又邁出了重要的一步,該通路將激活的受體復(fù)合物同基因的轉(zhuǎn)錄聯(lián)結(jié)起來。JAK-STAT途徑目前被認(rèn)為是瘦素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑。3.2糖尿病大鼠響應(yīng)面ptinrb的表達(dá)瘦素和瘦素受體在引起2型糖尿病尤其是胰島素抵抗中起著重要作用。Leptin基因突變致瘦素合成缺陷和LeptinR基因突變致瘦素受體功能缺陷均可引起肥胖。但在人類,絕大多數(shù)肥胖和糖尿病患者未發(fā)現(xiàn)其Leptin基因或LeptinR基因存在著有意義的突變,他們的體內(nèi)并不缺乏瘦素,反而表現(xiàn)為高瘦素血癥、瘦素抵抗,提示肥胖與瘦素抵抗更為相關(guān)。瘦素受體和受體后信號(hào)傳遞通路的異常,是瘦素抵抗發(fā)生的病理基礎(chǔ)和重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)中,STZ糖尿病大鼠下丘腦LeptinR及其mRNA表達(dá)減少。盡管有研究顯示,糖尿病大鼠LeptinRbmR-NA在下丘腦弓狀核中的表達(dá)與正常大鼠間無差異,但也有研究表明,糖尿病大鼠LeptinRa含量及表達(dá)均減少。本實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)糖尿病大鼠下丘腦LeptinR含量及mRNA表達(dá)的減少,可能主要是LeptinRa的減少,盡管LeptinRb是主要的功能受體,但CNS中LeptinRa和LeptinRb共存,且有相互作用,LeptinRa的減少也可能會(huì)影響功能受體LeptinRb的功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,LeptinR及其受體后傳導(dǎo)功能明顯受瘦素的影響。如老年大鼠存在瘦素抵抗,下丘腦的瘦素?cái)z取減少,且下丘腦的瘦素受體減少,而慢性瘦素側(cè)腦室灌注導(dǎo)致磷酸化的瘦素受體和STAT增多。糖尿病大鼠下丘腦LeptinR表達(dá)的減少,勢(shì)必會(huì)影響Leptin與之結(jié)合,從而影響受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。瘦素的生物學(xué)效應(yīng)和下游的神經(jīng)內(nèi)分泌遞質(zhì)的作用不能正常發(fā)揮,這可能是糖尿病大鼠出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂的中樞機(jī)制之一。我們以中醫(yī)針灸“治未病”理論為指導(dǎo),提出標(biāo)本配穴法,即以固護(hù)正氣的腧穴為本,以祛除邪氣的腧穴為標(biāo),兩者配合應(yīng)用的腧穴配伍方法,選取關(guān)元、足三里、胰俞為治療穴位。中醫(yī)針灸“治未病”以正氣為本,固護(hù)先天和后天是其基礎(chǔ)和關(guān)鍵,通過“治”達(dá)到“防”的目的,以療疾防變、調(diào)節(jié)機(jī)能。足三里為胃經(jīng)合穴,胃腑之下合穴,針之可調(diào)理脾胃,補(bǔ)益氣血生化之源,固護(hù)后天之本;關(guān)元為任脈腧穴,也是足三陰經(jīng)與任脈交會(huì)穴,為元陰、元陽關(guān)藏出入之所,針之可益精補(bǔ)氣,扶助人體先天之本。足三里、關(guān)元配合,兼顧先天和后天,補(bǔ)益正氣,再與治療消渴的效穴胰俞相配伍,則可達(dá)到以治為防、防微杜漸的目的。“標(biāo)本配穴”針刺能使糖尿病大鼠下丘腦LeptinR及其mRNA的表達(dá)明顯增多,說