絲素蛋白的物理和生物相容性

絲素蛋白的物理和生物相容性

絲綢中的絲綢蛋白質(zhì)是由18種氨基酸組成的天然蛋白質(zhì)。純度高，具有許多獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，尤其是對(duì)生物的良好抵抗力。近年國(guó)內(nèi)外將家蠶絲蛋白用于酶固定化材料、創(chuàng)面保護(hù)材料、抗凝血材料、藥物控制釋放材料、接觸眼鏡等的研究都很活躍。1重復(fù)序列片段和親水性大側(cè)鏈的氨基酸蠶絲是由家蠶生產(chǎn)的蛋白質(zhì),蠶絲由絲素蛋白和絲膠蛋白組成。家蠶絲素蛋白是由重鏈(H鏈)、輕鏈(L鏈)及P25糖蛋白組成的復(fù)合體。從結(jié)構(gòu)上可以把絲素蛋白看成是天然的嵌段共聚物,由一些小的疏水性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸)構(gòu)成一些重復(fù)序列片段和一些親水性大側(cè)鏈的氨基酸構(gòu)成的一些片段組成。這些疏水性片段容易通過氫鍵和疏水相互作用形成β-片層結(jié)構(gòu),從而構(gòu)成蠶絲的高強(qiáng)度力學(xué)基礎(chǔ),而親水以及大側(cè)鏈部分則構(gòu)成了較為不規(guī)則的部分,賦予蠶絲以較高的彈性和好的韌性。蠶絲通過脫膠、溶解、透析后得到的再生絲素蛋白一般分子量有所減少,幾乎只含有絲素H鏈,是比較純的蛋白材料。絲素H鏈一般認(rèn)為有無軌卷曲、silkⅠ、silkⅡ、silkⅢ4種結(jié)構(gòu)。絲素蛋白在濃溶液中容易形成silkⅠ結(jié)構(gòu),親水性較好,所以絲素溶液的濃溶液比較穩(wěn)定,不易形成沉淀;而在稀溶液中容易形成silkⅡ結(jié)構(gòu),親水性較差,反而容易結(jié)晶析出形成沉淀。絲素在高濕、高溫、應(yīng)力,或加入糖、乙醇、甲醇、聚乙二醇等其他物質(zhì)時(shí)容易形成silkⅡ結(jié)構(gòu)。2再生絲素材料生物相似性研究蠶絲作為縫合線已經(jīng)使用了幾百年,其生物相容性公認(rèn)是比較好的,尤其是脫過膠的蠶絲以及再生的絲素蛋白具有很好的生物相容性,目前對(duì)于絲素材料的生物相容性又進(jìn)行了更細(xì)致的研究。上海生物材料研究測(cè)試中心選擇培養(yǎng)23d生長(zhǎng)旺盛的L-929小鼠成纖維細(xì)胞,采用細(xì)胞增殖度試驗(yàn)和溶血試驗(yàn),對(duì)醫(yī)用絲素蛋白再生膜進(jìn)行細(xì)胞毒性和溶血反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明:該再生膜無明顯細(xì)胞毒性存在。另外他們還將醫(yī)用絲素蛋白膜材料按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織標(biāo)準(zhǔn)要求制備浸提液,進(jìn)行急性全身毒性試驗(yàn)、皮膚原發(fā)刺激試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn),以及Ⅰ型膠原、纖維連接蛋白mRNA基因表達(dá)等試驗(yàn),綜合分析評(píng)價(jià)其生物相容性,都顯示陰性結(jié)果。從整體、細(xì)胞和分子生物學(xué)水平研究提示:醫(yī)用絲素蛋白膜具有良好的生物相容性。Sugihara研究了蠶絲無紡網(wǎng)植入體內(nèi)的反應(yīng)。在植入皮下后,無紡網(wǎng)引起了一個(gè)輕微的異物反應(yīng)而沒有形成纖維化,在23種免疫反應(yīng)表達(dá)基因中,僅僅移植禁止因子在很短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出高的mRNA表達(dá),在植入的6個(gè)月內(nèi)沒有明顯的淋巴細(xì)胞的滲入被觀察到。這個(gè)結(jié)果說明絲素?zé)o紡網(wǎng)的良好的生物相容性。再生絲素材料同樣具有良好的血液相容性。Sakabe所做的絲素植入體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,再生絲素材料具有抗血栓性和良好的血液相容性。正常人血的凝血時(shí)間分別為:PT11±3s;APTT28±10s;TT16±5s。表1數(shù)據(jù)表明,楊新林所采集的血液樣品的凝血時(shí)間在正常范圍之內(nèi),制備的絲素膜在與血漿接觸后,凝血時(shí)間變化不大,可見未經(jīng)過任何處理的絲素膜本身血液相容性良好,基本不會(huì)影響血液的凝血過程。3絲素—絲素蛋白的抗原性DavidLKaplan認(rèn)為脫過膠的絲素纖維對(duì)于免疫系統(tǒng)是惰性的,甚至能抑制巨嗜細(xì)胞的活性而絲膠則表現(xiàn)出潛在的免疫活性。體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)通過研究IL-1βandCOX-2的表達(dá),免疫學(xué)證明:絲素反應(yīng)與膠原相似,細(xì)胞體外增殖在絲素上好于膠原,BMSCs細(xì)胞在絲素、膠原上相同。組織學(xué)觀察植入兔肌肉中6星期后,絲素表面反應(yīng)弱于膠原。SantinY用血漿與絲素接觸的研究表明,絲素與體液的相互作用過程中,免疫活性細(xì)胞的黏附較少,黏附上去的免疫細(xì)胞的活性較低,表明絲素的血液相容性良好,基本不會(huì)影響血液的凝血過程。LMeinel也認(rèn)為絲素蛋白只具有很低的潛在免疫原性。4fpsd的降解蠶絲作為縫合線使用過程中發(fā)現(xiàn),一般在體內(nèi)1年,絲素纖維喪失大部分的拉伸強(qiáng)力,2年后在移植處無法辨認(rèn)。由于美國(guó)藥典關(guān)于可吸收(縫合線)生物材料的定義是:“在生物體植入后60d內(nèi)應(yīng)失去大部分強(qiáng)度”,所以蠶絲縫合線被FDA歸屬于不可降解一類。但是,Lam認(rèn)為絲素是可生物降解的,這是因?yàn)榻z素對(duì)蛋白水解酶敏感。對(duì)體外絲素的研究表明:蛋白酶(如糜蛋白酶)將蛋白質(zhì)的小結(jié)晶區(qū)轉(zhuǎn)化為縮氨酸,然后縮氨酸被細(xì)胞吞噬進(jìn)一步的降解,糜蛋白酶(由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生)能降解絲素。李明忠的研究發(fā)現(xiàn),多孔絲素膜可被多種蛋白酶降解。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,多孔絲素膜埋植于大鼠皮下3個(gè)月內(nèi)逐步被降解90%以上,6個(gè)月時(shí)已基本消失。一般地,絲素在體內(nèi)被緩慢地吸收,吸收的速率與移植點(diǎn)、機(jī)械環(huán)境、病體的健康和生理特點(diǎn)、種類(生絲或脫膠絲)及絲素纖維直徑有關(guān)。并且蠶絲處理過程中產(chǎn)生的變體導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化可能使絲素的降解潛在增長(zhǎng)或降低,通過調(diào)節(jié)材料的凝聚態(tài)結(jié)構(gòu)可以控制其生物降解速度。5絲素蛋白對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Minoura1995年發(fā)現(xiàn)從絹絲腺中取出的絲素蛋白成膜以后能夠支持大鼠L-929細(xì)胞的黏附與增值,能夠保持細(xì)胞功能,與膠原蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。其后KuniyoInouye1998年在絲素膜表面進(jìn)行成纖維細(xì)胞、皮膚表皮細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果同樣表明,細(xì)胞在絲素膜表面的黏附率和增殖速度,與在膠原蛋白膜表面接近。Gotoh后來發(fā)現(xiàn)用9~9.5MLiBr溶解家蠶繭殼后所得的再生絲素蛋白膜同樣也可以支持細(xì)胞的黏附與生長(zhǎng)。他們把這種性能歸功于絲素膜表面的精氨酸的正電荷以及C-末端非重復(fù)序列與細(xì)胞表面負(fù)電荷的作用。姚敏采用培養(yǎng)液DMEM加5%絲素蛋白溶液,對(duì)照組采用培養(yǎng)液DMEM加5%生理鹽水的方法,對(duì)表皮細(xì)胞培養(yǎng),進(jìn)行表皮細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、3H-胸腺嘧啶核苷測(cè)定等比較觀察,結(jié)果顯示絲素蛋白對(duì)表皮細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。Unger考察了一系列細(xì)胞包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(1321N1),上皮細(xì)胞(A549),上皮細(xì)胞(CACO-2),角化細(xì)胞(HaCaT),內(nèi)皮細(xì)胞(HPMECST1.6R),纖維原細(xì)胞(MRC-5),造骨細(xì)胞(MG63),上皮細(xì)胞(HSTML-12),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(U373MG)在絲素納米無紡布上的培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)情況良好,形態(tài)正常。Byung-MooMin在絲素納米電紡絲上培養(yǎng)人角化細(xì)胞NHOK、NHEK、纖維原細(xì)胞(NHGF)也表明,細(xì)胞的貼壁能力和形態(tài)未見明顯改變,也未見明顯毒性,能支持細(xì)胞正常生長(zhǎng),呈現(xiàn)正常的生長(zhǎng)繁殖曲線。MasuhiroTsukada在絲素上培養(yǎng)了各種人體細(xì)胞,包括細(xì)胞SW1116,KB(人口角癌細(xì)胞),Colo201(人腺癌),QG56(人肺癌細(xì)胞),昆蟲細(xì)胞Sf9,BmN4,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在絲素和膠原涂層上生長(zhǎng)相同,30%~50%高于處理過的聚苯乙烯,只有腫瘤細(xì)胞(C181和P087)在3種不同的基質(zhì)上生長(zhǎng)相同。Jin報(bào)道絲素納米無紡網(wǎng)支持人的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的粘附、增值。江瑩也證實(shí)了脫膠后的絲素具有良好的細(xì)胞親和力,利于骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、增殖。LorenzUebersax采用3種材料:I型膠原、絲素蛋白、聚鳥氨酸,比較胚胎干細(xì)胞在其上的培養(yǎng),結(jié)果表明絲素材料上培養(yǎng)的細(xì)胞的增值活動(dòng)較弱而代謝活動(dòng)較強(qiáng),絲素可以作為胚胎干細(xì)胞的包裝材料,用于治療肌苷缺失癥。為了解釋絲素蛋白不含有RGD序列而具有良好的細(xì)胞黏附能力,Yamada用胰凝乳蛋白酶分解絲素蛋白,采用凝膠層析柱分離得到各種小肽,分析了降解后多肽的生物活性。發(fā)現(xiàn)了2種親水性多肽:VITTDSDGNE和NINDFDED相當(dāng)于RGD,對(duì)人纖維原細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。6絲素促進(jìn)ec細(xì)胞生長(zhǎng)絲素膜表面可以通過接枝上RGD或者其他活性片斷來拓寬他的用途,chen發(fā)現(xiàn)RGD改性后的絲素蛋白提高了造骨細(xì)胞,纖維原細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的黏附、伸展、增殖和分化。同樣Kardestuncer研究發(fā)現(xiàn)RGD改性后的絲素蛋白提高了對(duì)于腱細(xì)胞的黏附、增殖,顯著增加了腱細(xì)胞Col-I的分泌。楊新林采用先在絲素膜上結(jié)合RGD的抗體IgG,再將RGD結(jié)合到絲素膜表面RGD抗體IgG上,制備成RGD-IgG-SF絲素膜,種植培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC細(xì)胞)于該改性絲素膜的表面,證明改性絲素膜能有效地促進(jìn)EC細(xì)胞的生長(zhǎng)。Sofia也指出通過在絲素表面接枝甲狀旁腺素(PTH),能夠促進(jìn)造骨細(xì)胞在體外的分化。如果使用溶液狀態(tài)在絲素膜上培養(yǎng),則能增加細(xì)胞的粘附,但是不能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。最近Karageorgiou發(fā)現(xiàn)絲素蛋白膜表面用骨生成蛋白(BMP-2)表面接枝后提高了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。DavidL.Kaplan分別采用BMP-2接枝、溶液浸泡以及沒有BMP-2的絲素膜培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞,檢測(cè)堿性磷酸酶活性、鈣沉積、膠原I分泌、骨沉積,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP-2接枝的絲素膜效果比較好。Tsukada,Masuhiro發(fā)現(xiàn)在絲素上黏附很多L-929細(xì)胞而接枝PEG后黏附很少且沒有發(fā)現(xiàn)偽足。絲素表面接枝精氨酸,纖維原細(xì)胞L-929培養(yǎng)在其上培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)接枝后降低了絲素表面的黏附性,在絲素上可以觀察到絲狀偽足,接枝后的沒有觀察到絲狀偽足。YasushiTamada采用氟磺酸吡啶懸浮絲素粉末磺酸化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)絲素表面磺酸化后具有抗凝血性能。楊新林用SO2和NH3等離子體處理絲素膜,發(fā)現(xiàn)等離子體處理后,絲素蛋白膜表面分別被磺酸化和氨基化并均能促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)生長(zhǎng),而且對(duì)細(xì)胞形態(tài)和產(chǎn)生Ⅷ凝血因子的功能沒有明顯的影響。7絲素蛋白的誘導(dǎo)血管化能力生物材料植入體內(nèi)要能夠形成新的組織或者誘導(dǎo)生成新的組織,血液供應(yīng)是其關(guān)鍵,沒有血供的組織是死的組織。因此,材料的誘導(dǎo)血管化能力是組織修復(fù)的關(guān)鍵所在。材料的誘導(dǎo)血管化能力可以通過體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和植入體內(nèi)觀察形成血管網(wǎng)的情況來研究。謝菁使用豬髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞株在絲素膜表面培養(yǎng),結(jié)果顯示,絲素薄膜是對(duì)貼壁依賴型內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)具有支持作用的表面材料。R.E.Unger使用人內(nèi)皮細(xì)胞HPMEC-ST1、ISO-HAS-1在絲素?zé)o紡布上培養(yǎng),結(jié)果顯示絲素?zé)o紡布的細(xì)胞相容性好,能使內(nèi)皮細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)、形態(tài)正常。楊新林采用小鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,以絲素、經(jīng)過SO2低溫等離子體技術(shù)處理后的絲素、膠原和聚苯乙烯等幾種材料為基底,在上面種植血管內(nèi)皮細(xì)胞,研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、黏附和相關(guān)的功能變化情況,結(jié)果表明,血管內(nèi)皮細(xì)胞在絲素上的生長(zhǎng)情況比膠原蛋白要好。SabineFuchs從人的外周血管中分離得到血管內(nèi)皮細(xì)胞(OECs),在絲素?zé)o紡網(wǎng)中培養(yǎng),通過電子顯微鏡、熒光免疫檢驗(yàn)和基因分析,可以觀察到OECs形成了不同的細(xì)胞層覆蓋在單根絲素纖維上。把這種帶細(xì)胞的無紡網(wǎng)埋植入血纖維凝膠中發(fā)現(xiàn),OECs從絲素支架上遷移到血纖維形成的血塊中并形成了血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果都說明絲素蛋白具有良好的誘導(dǎo)血管化能力?？v上所述,絲素蛋白用于生物材料具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)安全性:蠶絲是非脊椎動(dòng)物鱗翅目昆蟲分泌到體外的天然高純度蛋白質(zhì),不含細(xì)胞器等生物雜質(zhì),向人類傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)是比較小的。絲素蛋白比較容易從蠶絲中提純,其具有明確的一級(jí)結(jié)構(gòu),氨基酸排列順序是已知的,不存在潛在的危害。(2)可設(shè)計(jì)性:絲素蛋白具有從無規(guī)卷曲到絲素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等4種高級(jí)結(jié)構(gòu),這些高級(jí)結(jié)構(gòu)具有不同的物理性能,它們之間相互轉(zhuǎn)化,控制絲素蛋白生成不同的結(jié)構(gòu)及各種結(jié)構(gòu)之間的比例可以得到各種性能的材料。另外絲素蛋白可以很容易制成溶液、絲、膜、水凝膠、三維多孔材料以適應(yīng)不同的用途。其表面可以通過接枝、涂覆來進(jìn)行改性處理,也可以通過與其他材料的復(fù)合來改善其各種性能。(3)良好的生物相容