靜電紡絲法制備小口徑聚氨酯人工血管及其性能研究

靜電紡絲法制備小口徑聚氨酯人工血管及其性能研究

人工血管作為血管移植的一種重要的臨床藥物，在臨床上具有重要的應(yīng)用價值和前景。目前大中口徑人工血管的臨床應(yīng)用已取得較為滿意的效果,但小口徑人工血管由于生物相容性差引起內(nèi)膜增生不良、力學(xué)性能不合適等缺點(diǎn)嚴(yán)重降低移植通暢率。本研究選用具有優(yōu)良生物相容性及力學(xué)性能的聚氨酯(PU)為原材料,以靜電紡絲法為制備方法,以期獲得具有優(yōu)良力學(xué)性能和生物相容性的血管移植替代物。1材料和方法1.1wst-8、dmso聚氨酯(Sigma,USA);DMF,THF(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司,AR,上海);MTT、WST-8、DMSO(Sigma,USA);小牛血清、胎牛血清、DMEM(Gibco,USA);L-谷氨酰胺、胰蛋白酶(上海生工有限公司);L929(上海生命科學(xué)研究院),人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC,上海拜力生物有限公司);e-PTFE人工血管(Gore,USA)。1.2接收裝置與實(shí)驗(yàn)儀器靜電紡絲裝置由高壓靜電發(fā)生器、噴液裝置和收集裝置組成(圖1)。裝有聚合物溶液的注射器(2)固定于注射泵上,紡絲液由鈍端針頭(3)流出,針頭與高壓電源(1)的正極相連,并水平固定于高速旋轉(zhuǎn)的接收裝置(4)前方,接收裝置接地。通過在針頭與收集裝置間施加高壓,形成強(qiáng)電場,聚合物溶液在電場力作用下拉伸形成噴射細(xì)流,隨溶劑揮發(fā),聚合物形成超細(xì)纖維并在接收裝置上沉積。微機(jī)控制電子萬能(拉力)試驗(yàn)機(jī)(深圳市庫泰克電子材料技術(shù)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(SheLL,USA);倒置熒光顯微鏡(上海長方光學(xué)儀器有限公司);自動酶聯(lián)免疫檢測儀(深圳雷杜生命科學(xué)儀器有限公司);掃描電鏡(Jeol5910Lv,日本)。1.3聚氨酯紡絲液的制備以DMF和THF混合溶液(質(zhì)量比2∶1)作為溶劑,制備不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的聚氨酯紡絲液。參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定紡絲過程參數(shù),通過靜電紡絲法制備4mm口徑人工血管。1.4測試指標(biāo)1.4.1微觀結(jié)構(gòu)觀察1.4.2體積、密度取PU人工血管矩形樣本,測量樣本的長、寬、厚,稱量干重(m),計算樣本體積(V)和密度(ρ)。代入公式ε=(1-ρ/ρ0)×100%,計算樣本孔隙率ε(ρ0為PU的標(biāo)準(zhǔn)密度1.18g/mL)。1.4.3拉伸性能測試制備管壁厚度約為0.2mm的PU管狀支架,利用微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)測試其拉伸性能。初始測試長度為50mm,以50mm/min的速度勻速拉伸,直至樣本斷裂,記錄各數(shù)據(jù)。1.4.4細(xì)胞耐心檢測使用一種已應(yīng)用于臨床的4mm口徑e-PTFE人工血管為對照組,研究靜電紡絲法制備的小口徑聚氨酯人工血管的細(xì)胞相容性。1.4.4.1.細(xì)胞毒性試驗(yàn)1.4.4.細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果取鋪有PU和e-PTFE樣品的96孔板,接種HUVEC細(xì)胞懸液培養(yǎng)1、2、3、4h后分別檢測兩種材料表面的細(xì)胞黏附情況,熒光顯微鏡觀察并拍片,每個樣品選取9個不同位置的照片,用凝膠成像分析系統(tǒng)圖像處理軟件分析照片中的細(xì)胞數(shù)量,同樣條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,取平均值作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。1.4.4.dmem和wst-8對vec細(xì)胞生長的影響取鋪有PU和e-PTFE樣品的96孔板,接種HUVEC細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng),每天更換1次培養(yǎng)液,并分別取1組樣品,去除培養(yǎng)液后加入DMEM和WST-8,孵育4h后,檢測吸光度值(波長450nm)。1.5統(tǒng)計分析方法定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。纖維直徑、孔隙率均數(shù)比較用單因素方差分析,生物學(xué)檢測的數(shù)據(jù)使用廣義線性模型進(jìn)行統(tǒng)計分析,固定時間因素組間比較使用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。2pu人工血管的結(jié)構(gòu)表征本實(shí)驗(yàn)通過靜電紡絲法制備小口徑聚氨酯人工血管60根,內(nèi)徑4mm,壁厚(0.25±0.05)mm,管長(7.0±2.1)cm,外觀形貌見圖2。經(jīng)測量本實(shí)驗(yàn)制備的PU人工血管的纖維平均直徑為(732.72±52.22)nm。當(dāng)滾軸轉(zhuǎn)速為1000r/min時,纖維具有一定取向,且排列較為規(guī)整(圖3B)。而當(dāng)轉(zhuǎn)速低于或高于1000r/min時,收集到的纖維排列雜亂無緒(圖3A,C)。2.1孔絡(luò)率測定本實(shí)驗(yàn)研究了不同制備條件—紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、滾軸轉(zhuǎn)速、管壁厚度對PU管狀支架孔隙率的影響。2.1.1不同紡織液的質(zhì)量比以質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%,9%和10%的紡絲液進(jìn)行靜電紡絲制備PU管狀支架,3組支架的管壁厚度相近,約0.2mm,結(jié)果見表1。2.1.2種pu不同支架的孔隙率滾軸轉(zhuǎn)速分別為500、1000、1500r/min,制備PU管狀支架,測其孔隙率,3種支架的管壁厚度相近,約0.15mm,結(jié)果見表2。2.1.3不同壁厚2.2軸向拉伸性能試驗(yàn)結(jié)果PU管狀支架主要力學(xué)性能測試結(jié)果(表4),本實(shí)驗(yàn)制備的人工血管具有較為均一的力學(xué)性能。2.3生物學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果2.3.1e-ptfe-pu人工血管由圖4可見兩種血管都是由超細(xì)纖維構(gòu)成的三維網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu),但e-PTFE人工血管是由微米級別的網(wǎng)狀纖維及其所連接的結(jié)點(diǎn)組成,PU人工血管則是由平均直徑(732.72±52.22)nm的多層亞微米纖維疊加而成的三維多孔結(jié)構(gòu)。2.3.3pu人工血管細(xì)胞固結(jié)實(shí)驗(yàn)2.3.4pu-血管細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)3人工血管的孔隙率靜電紡絲法制備的人工血管是由多層超細(xì)纖維疊加而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),隨著紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高,液體黏度和表面張力隨之增大,導(dǎo)致纖維直徑升高。本實(shí)驗(yàn)制備的電紡支架纖維平均直徑為(732.72±52.22)nm,與天然細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白纖維尺寸(50~500nm)相近,有利于細(xì)胞在血管支架上的黏附和增殖。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的紡絲液在紡絲過程中容易出現(xiàn)珠狀纖維,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的人工血管纖維平均直徑最大,且在電紡過程中容易出現(xiàn)噴絲口凝結(jié),導(dǎo)致電紡中斷。因此本實(shí)驗(yàn)將最佳紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)定為9%。人工血管的纖維排列取向?qū)?xì)胞在支架上的生長行為有影響,電紡過程中纖維排列取向受接收裝置的滾軸轉(zhuǎn)速影響,當(dāng)滾軸的表面線速度與射流沉積時溶劑的揮發(fā)速度匹配時,纖維以圓周的方式緊密附著于滾軸表面,該速度稱排列取向速度。當(dāng)滾軸速度小于或高于排列取向速度,都無法收集到取向較好的纖維。本實(shí)驗(yàn)中的排列取向速度為1000r/min。以該速度作為接收裝置的滾軸轉(zhuǎn)速,所得到的人工血管具有良好的纖維取向、排列規(guī)整,有利于細(xì)胞的黏附和增殖。理想的人工血管還必需具備適當(dāng)?shù)目紫堵?若孔隙率低,新生內(nèi)膜的營養(yǎng)難以維持將導(dǎo)致管腔狹窄甚至閉塞。反之,過高的孔隙率則可能引起動脈周圍血腫甚至動脈瘤。實(shí)驗(yàn)顯示人工血管孔隙率受多個因素影響。一方面,紡絲液質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高,纖維直徑隨之增大,管壁密度增加,導(dǎo)致PU人工血管的孔隙率逐漸下降。另一方面,人工血管的孔隙率與纖維取向及排列密切相關(guān),纖維排列越規(guī)整,孔隙率越小。當(dāng)滾軸轉(zhuǎn)速達(dá)到排列取向速度時,纖維取向一致,排列規(guī)整,纖維層與層之間排列非常縝密,可顯著提高血管的力學(xué)性能。高于或低于該速度時血管的孔隙率增加,同時力學(xué)性能變差。本實(shí)驗(yàn)中,排列取向速度下制備的人工血管孔隙率仍能達(dá)到較高水平,同時保證了較好的力學(xué)性能。體內(nèi)血管由于肌肉收縮、運(yùn)動等原因不斷地受到軸向應(yīng)力,因此理想的人工血管必需具有與人體自然血管相近甚至更好的軸向力學(xué)性能。人體股動脈的極限應(yīng)力為1~2MPa。Vaz等制備的復(fù)合支架極限應(yīng)力為(4.3±0.2)MPa。潘仕榮等制備的微孔血管軸向抗張強(qiáng)度為(1.55~4.36)MPa。本實(shí)驗(yàn)制備的人工血管的抗拉性能較均一,無明顯落差,軸向抗拉強(qiáng)度為(5.85±0.62)Mpa,高于人體血管承受的壓力,具有良好的軸向抗拉性及伸展性能。細(xì)胞毒性試驗(yàn)是醫(yī)用生物材料安全性的有效評價方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:PU人工血管無細(xì)胞毒性,符合生物材料的要求。正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞可持續(xù)釋放生物活性物質(zhì)、促進(jìn)纖溶作用、防止血栓形成并抑制SMC增生,因此人工血管植入體內(nèi)后能否快速內(nèi)皮細(xì)胞化是小口徑人工血管能否保持通暢的重要因素。本實(shí)驗(yàn)中接觸第1、2小時兩組細(xì)胞黏附量有顯著差異,培養(yǎng)第96、120小時兩組增殖率有顯著差異。表明PU人工血管較e-PTFE的優(yōu)勢在于:有利于內(nèi)皮細(xì)胞早期黏附,可以促進(jìn)血管內(nèi)皮化的進(jìn)程,有利于避免血栓形成、管腔狹窄或閉塞。隨培養(yǎng)時間增長,PU人工血管顯示出其有利于內(nèi)皮細(xì)胞增殖的優(yōu)勢。綜上所述,以聚氨酯為原料,通過靜電紡絲法制備的小口徑PU人工血管具有良好的三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),軸向抗拉性能優(yōu)于自然血管和國內(nèi)外的人工血管報道,并具有優(yōu)于e-PTFE血管的細(xì)胞相容性,擁有進(jìn)一步應(yīng)用于血管移植物研究的前景。掃描電子顯微鏡觀察人工血管的微觀形貌并計算纖維直徑的平均值。兩種人工血管滅菌后,加入含10%小牛血清的DMEM制備浸提液。取96孔板,接種小鼠成纖維細(xì)胞(L929)懸液進(jìn)行培養(yǎng),測試組加入PU血管浸提液,對照組加入e-PTFE血管浸提液,空白對照組加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液,陽性對照組加入含50%DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后,加入MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h后加入DMSO,檢測吸光度值(波長570nm),代入公式:RGR%=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值×100%,計算細(xì)胞相對增殖率(RGR),每組重復(fù)3次取平均值。參照六級毒性評級標(biāo)準(zhǔn)將RGR值轉(zhuǎn)換成毒性分級:RGR≥100%為0級,75%~99%為I級,50%~74%為II級,25%~49%為III級,1%~24%為IV級,0為V級。毒性分級為0~I級即可