實(shí)驗(yàn)一 糕點(diǎn)中菌落總數(shù)的測(cè)定

1、了解細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)的意義。2、掌握樣品稀釋處理的方法和菌落總數(shù)計(jì)數(shù)的方法3、掌握食品細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定報(bào)告方式。4、熟練無(wú)菌操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)一糕點(diǎn)中菌落總數(shù)的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、恒溫水浴鍋、托盤天平、電爐、吸管、廣口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、試管、試管架、酒精燈、均質(zhì)器或乳缽、滅菌刀或剪刀、滅菌鑷子、75%酒精棉球、玻璃蠟筆、登記薄2、培養(yǎng)基和試劑：75%乙醇、生理鹽水(蒸餾水）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。二、實(shí)驗(yàn)材料菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理,在一定條件下培養(yǎng)后(如培基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等)，所得1mL(g)檢樣中所含菌落的總數(shù)。本方法規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫性需氧的菌落總數(shù)。

菌落總數(shù)主要作為判定食品被污染程度的標(biāo)志，也可以應(yīng)用這一方法觀察細(xì)菌在食品中繁殖的動(dòng)態(tài)，以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)。(一）最先準(zhǔn)備的器材（清洗、烘干、包扎、滅菌）*8規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個(gè) 稀釋樣品（配制生理鹽水）2、250ml三角瓶 1個(gè) 配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂 3、18×180mm試管 5支 稀釋樣品（9ml）4、1ml移液管 5支5、直徑為90mm平皿 8套 倒?fàn)I養(yǎng)平板6、250ml量筒 1支7、玻璃珠：直徑約5mm（二）應(yīng)滅菌、消毒的器材剪刀1把不銹鋼藥匙1把稱量紙：適量酒精消毒的器材：吸耳球1個(gè)，滴管膠頭5只（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)基總量 所用容器蒸餾水1瓶225ml/瓶500ml三角瓶平板計(jì)數(shù)瓊脂1瓶150ml/瓶250ml三角瓶稀釋水：每組5支 9ml/支18×180mm試管A.1平板計(jì)數(shù)瓊脂（platecountagar，PCA）培養(yǎng)基A.1.1成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g瓊脂15.0g蒸餾水1000mLpH7.0±0.2A.1.2制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15min。1、檢驗(yàn)程序菌落總數(shù)檢驗(yàn)程序：檢樣→做成幾個(gè)適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液→選擇2-3個(gè)適宜稀釋度各以1ml之量分別入滅菌平皿內(nèi)→每皿內(nèi)加入460C適量營(yíng)養(yǎng)瓊脂→菌落數(shù)→報(bào)告三、實(shí)驗(yàn)方法2、檢樣稀釋及培養(yǎng)（1）以無(wú)菌操作，將檢樣25g（或25ml）剪碎以后，放于含有225ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)預(yù)先置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~100000r/min的速度處理1min，做成1：10的均勻稀釋液。（2）用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下同），振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。（3）另取1ml的滅菌吸管，按上項(xiàng)操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。注意：①加入檢樣液時(shí)，吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也不得觸及管內(nèi)稀釋液，并將吸管內(nèi)的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。②吸管插入檢樣液內(nèi)取樣稀釋時(shí)，插入深度要達(dá)2.5cm以上,調(diào)整時(shí)應(yīng)使管尖與容器內(nèi)緊貼③每遞增稀釋一次，即換用另一支1ml滅菌吸管

（4）根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇2~3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。（5）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至460C營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[可放置在（（46±1）0C）水浴鍋內(nèi)保溫]注入平皿15ml~20mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻，同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。（6）等瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（36±1）0C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（48±2）h取出，計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目乘以倍數(shù)，即得1g（1mL）樣品所含菌落總數(shù)。

①培養(yǎng)基不能觸及平皿口邊沿，加入培養(yǎng)基后可正反兩個(gè)方向旋轉(zhuǎn)，但不可用力過(guò)度，以免濺起觸及上蓋。②檢樣從開(kāi)始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿，所用時(shí)間不宜超過(guò)20min③瓊脂凝固后，就立即將平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，以免細(xì)菌蔓延生長(zhǎng)。④如果把不能立即計(jì)數(shù)，要將平板放入0～4℃冰箱中，但不能超過(guò)24h。3、菌落計(jì)算方法（1）菌落計(jì)數(shù)方法做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀查，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。（2）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告①平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)，其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落數(shù)；如果有不同來(lái)源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。

②稀釋度的選擇

應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。若有兩上稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30～300之間，則視兩者之比如何來(lái)決定。若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若大于2