低聚異蔗糖對(duì)模擬失重大鼠腸道益生菌的影響

低聚異蔗糖對(duì)模擬失重大鼠腸道益生菌的影響

國(guó)內(nèi)外進(jìn)行的大量研究表明，在航空航天輕微壓力下和地面模擬喪失的條件下，身體中的鈣含量大量喪失，導(dǎo)致一系列與鈣代謝紊亂有關(guān)的疾病，如骨質(zhì)疏松癥、鈣流動(dòng)性障礙，并對(duì)運(yùn)動(dòng)員的健康構(gòu)成威脅。因此,對(duì)于如何預(yù)防失重骨質(zhì)丟失一直是航天醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn),在進(jìn)行機(jī)制研究的同時(shí),人們也從多種途徑包括膳食營(yíng)養(yǎng)途徑探討預(yù)防和緩解這種現(xiàn)象的可能性。研究發(fā)現(xiàn),非消化性寡聚糖能增加一些礦物質(zhì)在體內(nèi)的吸收和促進(jìn)骨骼的礦化。非消化性寡聚糖的這種作用可能主要是由于它們所具有的益生元的特性所引起的。非消化性寡聚糖是低聚果糖、水蘇糖和低聚異麥芽糖等的總稱,它們經(jīng)腸道益生菌酵解后,生成乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸,使腸道的pH降低,有助于鈣的溶解和吸收。業(yè)已發(fā)現(xiàn)在航天飛行期間,航天員腸道益生菌數(shù)量減少,出現(xiàn)腸道微生態(tài)失調(diào)的現(xiàn)象。本試驗(yàn)研究的主要目的是觀察低聚異麥芽糖對(duì)模擬失重大鼠的鈣代謝和骨丟失是否具有有益的影響,并探討可能的作用機(jī)制。1大鼠糞便中活菌集落的測(cè)定1.1動(dòng)物分組及喂養(yǎng)SPF級(jí)SD雄性大鼠(由北京動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)30只,體重(120±10)g,隨機(jī)平均分為3組:FC組:正常對(duì)照組,自由活動(dòng);SC組:模擬失重對(duì)照組。FC、SC兩組大鼠進(jìn)食SPF級(jí)普通飼料。SS組:模擬失重低聚異麥芽糖組,進(jìn)食在普通飼料基礎(chǔ)上添加5%(W/W)低聚異麥芽糖(低聚異麥芽糖含量為50%~55%)。3組大鼠均單籠喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲用純凈水,實(shí)驗(yàn)期為21天。1.2模擬失重模型的建立大鼠尾部懸吊,后肢離地,使軀干與地面成25°~30°夾角,大鼠前肢著地,可以自由活動(dòng)。1.3糞便標(biāo)本采集及處理分別在實(shí)驗(yàn)開始后的第7天、第14天和第21天,用逼迫法取大鼠新鮮糞便,求得糞便重量,以1ml生理鹽水稀釋后,震蕩器上震蕩混勻,然后用生理鹽水以10倍稀釋的比例稀釋成系列。1.4培養(yǎng)基的選擇和制備厭氧培養(yǎng)基(TPY、MRS)按熊德鑫的要求制備。1.5接種取上述處理的標(biāo)本系列稀釋液0.01ml接種到選擇性和非選擇性培養(yǎng)基上,分別置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。清點(diǎn)菌落數(shù)并鑒定菌株。1.6血樣采集于實(shí)驗(yàn)的第20d晚開始禁食12h,次日用2%的戊巴比妥鈉鹽溶液麻醉大鼠后,腹主動(dòng)脈采血。室溫下放置1h后,離心(3000mp×45min)分離血清。1.7血清鈣的測(cè)定采用血清鈣檢測(cè)試劑盒(北京朗道醫(yī)療用品有限公司),用比色法測(cè)定。1.8血清骨鈣素的測(cè)定用放射免疫法測(cè)定血清骨鈣素的含量,骨鈣素試劑盒由北方放射免疫試劑研究所提供。1.9骨密度測(cè)定大鼠處死,將大鼠后肢右側(cè)股骨取出并剔凈附著軟組織,用浸透生理鹽水的紗布包裹,檢測(cè)前去掉紗布,將樣本置于DPL+型雙能X射線骨密度檢測(cè)儀(美國(guó)LUNAR公司)上測(cè)定。1.10糞鈣和骨鈣的測(cè)定股骨標(biāo)本的處理:將骨密度測(cè)定后的股骨置于馬弗爐中灰化,灰化后稱重。將灰化后的股骨置于50ml容量瓶中用2%鹽酸溶解后定容備檢;在實(shí)驗(yàn)開始的第16、17、18d連續(xù)收集3d大鼠糞便,然后將糞便放入烤箱中120℃烤至恒重,取0.1g的干糞便置于50ml容量瓶中加40ml的2%鹽酸,置于搖床中220r/min震蕩2h,定容后靜置過夜備檢。用EDTA滴定法測(cè)定鈣量,鈣紅做指示劑。1.11計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析(1)飼料鈣表觀吸收率(%)=(平均每日鈣攝入量-每日糞鈣排出量)/平均每日鈣攝入量×100%。(2)每克糞便中的活菌集落對(duì)數(shù)值(CFU/g)=log[標(biāo)本重量(g)+稀釋液量(ml)]/標(biāo)本重量×稀釋倍數(shù)×菌落個(gè)數(shù)×102。用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示結(jié)果,Excell統(tǒng)計(jì)分析程序?qū)Y(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。2尾吊大鼠股骨鈣、骨鈣和糞鈣檢測(cè)2.1SC組大鼠糞便標(biāo)本與SS組糞便標(biāo)本益生菌(雙歧桿菌和乳桿菌)菌群檢測(cè)結(jié)果如表1所示。2.2各組大鼠不同時(shí)間內(nèi)糞便菌群檢測(cè)結(jié)果的分析列于表2中。2.3大鼠骨密度測(cè)定結(jié)果見圖1。由圖可知,懸吊3周后,SC組大鼠股骨骨密度顯著低于FC組(P<0.001),而SS組大鼠股骨骨密度顯著高于SC組(P<0.01)。2.4血鈣、骨鈣和糞鈣檢測(cè)結(jié)果2.4.1血鈣檢測(cè)結(jié)果見圖2。懸吊21d后SC組大鼠血清鈣濃度高于FC組(P<0.05)。SS組大鼠血鈣濃度低于SC組(P<0.05)。2.4.2骨鈣檢測(cè)結(jié)果見圖3。FC組和SS組大鼠股骨鈣的含量均顯著高于SC組(P<0.05)。表明尾吊大鼠股骨骨鈣出現(xiàn)大量丟失,低聚異麥芽糖具有減輕骨鈣丟失的作用。2.4.3大鼠飼料鈣的表觀吸收率檢測(cè)結(jié)果見圖4。SS組大鼠飼料鈣的表觀吸收率為48.2%,SC組為41.6%,二者相比差異具有顯著性(P<0.01)。2.5血清骨鈣素含量的測(cè)定結(jié)果見圖5。由圖看出,SC組骨鈣素濃度低于FC組(P<0.05),說明懸吊使大鼠的骨轉(zhuǎn)換率降低,骨丟失為低轉(zhuǎn)換型;SS組骨鈣素水平明顯高于SC組(P<0.05)。3低聚異麥芽糖對(duì)模擬失重大鼠血清bgp的作用目前國(guó)內(nèi)關(guān)于微重力條件下腸道菌群變化的研究剛剛起步。而腸道菌群作為人體數(shù)量最大,種類最多的細(xì)菌庫(kù),尤其是其中的益生菌的數(shù)量和比例對(duì)人體具有十分重要的生理意義。本實(shí)驗(yàn)采用尾吊大鼠的方法模擬失重,研究結(jié)果表明模擬失重條件下,雙歧桿菌的數(shù)量顯著減少(3次檢測(cè)的結(jié)果P值均小于0.0001),乳桿菌數(shù)量也明顯降低,這與美國(guó)生物衛(wèi)星上觀察到的結(jié)果相一致;在模擬失重條件下,導(dǎo)致大鼠腸道益生菌數(shù)量減少的確切原因尚不清楚,推測(cè)與模擬失重條件下消化道功能紊亂和免疫功能降低有關(guān)。低聚異麥芽糖是一種在體內(nèi)僅部分被消化的碳水化合物,SS組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量顯著增加,表明低聚異麥芽糖具有明顯的促進(jìn)模擬失重條件下大鼠腸道雙歧桿菌和乳桿菌增殖作用。從本研究的結(jié)果看,低聚異麥芽糖能夠有效地減輕模擬失重大鼠股骨骨質(zhì)丟失的作用,該作用可能與低聚異麥芽糖促進(jìn)益生菌增殖有關(guān)。體現(xiàn)在:3.1通過益生菌間接增加成骨細(xì)胞的活性成骨細(xì)胞是骨代謝的主要功能細(xì)胞。血清骨鈣素(boneglaprotein,BGP)由成骨細(xì)胞合成后,大部分沉淀于骨基質(zhì)中,少量直接分泌入血液循環(huán)。目前認(rèn)為BGP是骨有機(jī)質(zhì)礦化的必要物質(zhì),由成骨細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的BGP前體中的谷氨酸殘基,必須經(jīng)羧化生成ue160-羧基谷氨酸殘基后才具有正常的生理功能,維生素K是這一羧化過程的重要輔酶。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明低聚異麥芽糖可以提高模擬失重大鼠的血清BGP水平,說明低聚異麥芽糖可以促進(jìn)骨質(zhì)鈣化,這與維生素K防治骨質(zhì)疏松作用結(jié)果相一致,其作用機(jī)制可能是通過維生素K的作用途徑實(shí)現(xiàn)的,由于體內(nèi)的維生素K主要靠腸道中的益生菌合成。前已述及:模擬失重條件下,大鼠腸道益生菌數(shù)量明顯減少,由此造成維生素K合成量減少,這可能是模擬失重組大鼠血清BGP含量低的原因之一。并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低聚異麥芽糖能促進(jìn)腸道益生菌的增殖,所以推測(cè)低聚異麥芽糖提高模擬失重大鼠血清BGP水平可能是通過促進(jìn)腸道中益生菌的繁殖進(jìn)而合成維生素K而起作用的。3.2可促進(jìn)膳食鈣的吸收和利用非消化性寡聚糖(NDOS)能刺激一些礦物質(zhì)的吸收并促進(jìn)骨骼的礦化,NDOS功效評(píng)價(jià)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,NDOS能增加鈣、鎂、鋅和鐵等礦物質(zhì)的利用率,NDOS的這些作用可能主要是由于其所具有的益生元特性導(dǎo)致的。NDOS刺激礦物質(zhì)吸收的可能機(jī)制主要有:(1)NDOS通過小腸進(jìn)入盲腸和結(jié)腸后被存在于結(jié)腸的一些益生菌主要是雙歧桿菌選擇性發(fā)酵生成短鏈脂肪酸(SCFAS),pH降低,從而有利于腸鈣的溶解和吸收。(2)絨毛隱窩高度、每個(gè)隱窩上皮細(xì)胞數(shù)量和盲腸靜脈流量以及黏膜-漿膜鈣的流出(鈣被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑)等都因NDOS的作用而增加。(3)NDOS刺激鈣結(jié)合素(calbindin)-D9K的表