基于熒光原位雜交技術(shù)的海洋細(xì)菌分離鑒定

基于熒光原位雜交技術(shù)的海洋細(xì)菌分離鑒定

由于微生物過(guò)程的重要作用，對(duì)樣品中微生物的檢測(cè)和鑒定已成為控制和優(yōu)化自然環(huán)境污染的重要依據(jù)。然而，在自然環(huán)境中，很難形成具有優(yōu)勢(shì)的微生物。細(xì)菌多樣性給傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)帶來(lái)了很大困難，最終的微生物往往偏離原樣品，導(dǎo)致識(shí)別和鑒定錯(cuò)誤。此外，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法需要時(shí)間和工作，樣品中只有一部分微生物。例如，在海水中，培養(yǎng)的微生物僅占總數(shù)的0.001%0.1%，而在淡水和底泥中，僅占總數(shù)的0.25%。此外，還有一些細(xì)菌很長(zhǎng)很難分離。因此，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法受到了嚴(yán)重限制。為了解決這個(gè)問(wèn)題，越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始使用生物技術(shù)在環(huán)境樣品中分析微生物。生物技術(shù)不僅可以節(jié)省傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的時(shí)間，而且可以充分反映樣品中存在的微生物的組成，并能有效、快速地接收環(huán)境樣品的微生物信息。隨著時(shí)間的推移,分子生物學(xué)技術(shù)越來(lái)越成熟,特異性越來(lái)越強(qiáng),如今已能檢測(cè)特定微生物群落的動(dòng)態(tài)變化和活性.分子生物學(xué)技術(shù)所得的研究成果正開(kāi)始改變?nèi)藗儗?duì)微生物世界的觀點(diǎn).至今,開(kāi)發(fā)用于研究微生物群落的分子生物學(xué)技術(shù)主要是基于對(duì)核糖體RNA分子的小分子亞單元及基因的檢測(cè)和分析(對(duì)于原核生物是16SrRNA和rDNA分子),也有以特定的功能基因作為分子指標(biāo)的,如對(duì)好氧氨氧化菌進(jìn)行檢測(cè)的amoA基因,對(duì)反硝化菌進(jìn)行檢測(cè)的nirS和nirK基因等.1酶技術(shù)的總結(jié)1.1寡核苷酸探針fishFISH技術(shù)的主要原理為:將寡核苷酸探針用熒光染料標(biāo)記,再使之與固定在載玻片上的微生物樣品雜交;將未雜交的熒光探針洗去后,用共聚焦激光掃描顯微鏡或普通熒光顯微鏡進(jìn)行觀察和攝像.早在十幾年前,FISH就開(kāi)始被用于微生物的檢測(cè),并成為了微生物學(xué)的一個(gè)突破.用這一方法可以避免細(xì)菌的培養(yǎng),清楚并方便地觀察到樣品中細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)量和空間位置,而且可以通過(guò)不同的寡核苷酸探針同時(shí)對(duì)不同類(lèi)群的細(xì)菌在細(xì)胞水平上進(jìn)行原位的定性定量分析和空間位置識(shí)別.寡核苷酸探針是一段長(zhǎng)度為15～30個(gè)堿基的基因片斷,它容易滲透到目標(biāo)細(xì)胞或組織中.通常在寡核苷酸探針的5′端通過(guò)共價(jià)鍵與簡(jiǎn)單熒光染料分子鏈接.常用的熒光體有:熒光素(fluorescein)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)等,但更多的研究者使用羰花青(如Cy3或Cy5),因?yàn)轸驶ㄇ啻蟠筇岣吡薋ISH的靈敏度.FISH常用的分子指標(biāo)是rRNA,通常將它作為FISH檢測(cè)的靶序列.大部分FISH探針的靶序列為16SrRNA,也有將23SrRNA或16S和23S基因間隔區(qū)作為靶序列的.對(duì)每個(gè)分類(lèi)水平,根據(jù)rRNA目標(biāo)區(qū)域可設(shè)計(jì)寡核苷酸探針,進(jìn)行種屬特異性的鑒定.如今Internet上的公用數(shù)據(jù)庫(kù)包括了絕大部分培養(yǎng)微生物的16SrRNA序列和許多直接從環(huán)境中得到的微生物DNA序列.典型的FISH實(shí)驗(yàn)過(guò)程一般包括4個(gè)步驟:樣品的固定、雜交、未雜交探針的清洗以及標(biāo)記細(xì)胞的觀察.FISH技術(shù)已在環(huán)境樣品微生物分析中得到了較廣泛的應(yīng)用,如高效生物除磷(EBPR)反應(yīng)器污泥中微生物群落的測(cè)定、anammox菌多樣性研究、anammox菌的rDNA操縱子大片段16S23S間區(qū)和23SrRNA特性研究、微生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒插入體研究(克隆?FISH)、FISH與微量自動(dòng)射線(xiàn)照相術(shù)研究活性污泥中微生物對(duì)基質(zhì)的吸收特性等.1.2pcr擴(kuò)增檢測(cè)生物高分子的表達(dá)PCR技術(shù)是1985年美國(guó)Cetus公司的Mullis和Saiki等發(fā)明的一種基于在生物體外對(duì)特殊氨基酸進(jìn)行擴(kuò)增的引物延伸反應(yīng).它解決了環(huán)境樣品中提取的DNA量通常過(guò)低而不能很好分析的難題,是分子生物學(xué)研究的重大突破之一.它和FISH一樣,也是一種無(wú)需微生物培養(yǎng)、簡(jiǎn)單、快速、靈敏的細(xì)菌檢測(cè)技術(shù).PCR反應(yīng)中,多聚酶是一種催化DNA或RNA形成和修復(fù)的生物高分子,常用的多聚酶是從嗜熱細(xì)菌Thermusaquaticus分離的TaqDNA聚合酶,該酶在95℃時(shí)也不會(huì)變性,在65℃下可催化聚合反應(yīng).PCR反應(yīng)過(guò)程中,向前和向后的引物(引物一般是約為20個(gè)核苷長(zhǎng)的寡核苷酸)分別與待擴(kuò)增的DNA模板(稱(chēng)為靶序列)的正鏈和負(fù)鏈的兩端互補(bǔ),將引物片斷與待擴(kuò)增的DNA片斷混合并加熱變性,然后退火,此時(shí)引物片斷就和相應(yīng)的DNA模板互補(bǔ)雜交,加入的底物dNTPs和DNA聚合酶進(jìn)行DNA擴(kuò)增.這是PCR反應(yīng)一般程序(圖1)中的一個(gè)循環(huán).經(jīng)過(guò)若干循環(huán)后,DNA的數(shù)量為(1+X)n(X為反應(yīng)平均效率,n為循環(huán)次數(shù)).可見(jiàn),PCR的擴(kuò)增效率是相當(dāng)高的,它可以使一小段DNA(通常少于3000個(gè)堿基對(duì))擴(kuò)增100萬(wàn)倍,從而方便了微生物的鑒定.經(jīng)典PCR一般分為擴(kuò)增和檢測(cè)兩個(gè)階段,常用溴乙啶染色后的凝膠電泳作為定性檢測(cè)手段,用熒光標(biāo)記技術(shù)作為定量分析手段.從PCR技術(shù)發(fā)明至今,該技術(shù)已不斷得到改進(jìn).除經(jīng)典PCR以外,還開(kāi)發(fā)出了反轉(zhuǎn)錄PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、PCR芯片等.隨著電子技術(shù)的發(fā)展,這一技術(shù)必將有更好的前景.文獻(xiàn)總結(jié)了PCR及相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用情況.1.3分子克隆技術(shù)環(huán)境樣品微生物分析的一個(gè)較突出的問(wèn)題是得不到足夠的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分析.譬如10L生長(zhǎng)到最大濃度的E.Coli培養(yǎng)菌只包含7mgDNA多聚酶I,許多其他蛋白質(zhì)的量則更少.此外,微生物體內(nèi)的蛋白質(zhì),能被純化的部分幾乎不到一半,真核細(xì)菌的蛋白質(zhì)則更難得到,分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用克服了這一不足.分子克隆的主要技術(shù)要點(diǎn)是:將目標(biāo)DNA片斷插入一段自復(fù)制的DNA分子(克隆載體)中,而后目標(biāo)DNA片斷就和載體復(fù)制在一起,將這個(gè)攜帶著目標(biāo)DNA片斷的載體在宿主細(xì)胞(如E.Coli或酵母菌)中克隆后就可產(chǎn)生大量的被插入的目標(biāo)DNA片斷.1.4taqna多聚酶常用的DNA測(cè)序方法是自動(dòng)熒光DNA測(cè)序.先將DNA的4個(gè)堿基用不同顏色的染料著色,再將這些染料加在4個(gè)脫氧核苷的終端,從而使所有的DNA片斷以染料標(biāo)記的終端結(jié)束.這些DNA片斷接著在聚丙烯酰胺凝膠上被分離,而熒光則被激光激發(fā)后得到探測(cè).DNA測(cè)序與PCR類(lèi)似,采用高溫使DNA雙鏈變性,引物被退火后得到延伸.這一方法的優(yōu)點(diǎn)在于它可以進(jìn)行多輪測(cè)序反應(yīng)而不需要加入新的酶,就像PCR反應(yīng)一樣,而且,只要使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒mini-preps就能夠得到足夠的用于測(cè)序反應(yīng)的DNA.TaqDNA多聚酶也是DNA測(cè)序反應(yīng)中常用的酶,它能使染料標(biāo)記的DNA終端分布更加均勻,具有較高的測(cè)序準(zhǔn)確度.DNA測(cè)序中使用的模板主要是克隆載體和PCR擴(kuò)增DNA兩種,前者主要包括單鏈抗菌素載體、雙鏈質(zhì)粒載體、Phagemid載體(含有單鏈抗菌素復(fù)制源的雙鏈質(zhì)粒)等;后者主要包括單鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和雙鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.當(dāng)模板是PCR擴(kuò)增DNA時(shí),必須保證過(guò)量的引物在測(cè)序前得到清除,否則會(huì)影響測(cè)序結(jié)果.引物的去除可通過(guò)很多方法實(shí)現(xiàn),如從瓊脂電泳切膠回收法,酚—氯仿—乙醇法以及商品化的微柱純化法等.DNA測(cè)序后一個(gè)重要的步驟就是序列的分析,只有經(jīng)過(guò)準(zhǔn)確和合理的序列分析才能最終鑒定目標(biāo)微生物.目前,可以進(jìn)行DNA序列分析的工具很多,最常用的有以下幾種:a.序列數(shù)據(jù)的獲得.可以通過(guò)Entrez(由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心開(kāi)發(fā)),SRS(由歐洲生物信息學(xué)院開(kāi)發(fā)),DBGET/LinkDB(由日本Kyoto大學(xué)和東京大學(xué)人類(lèi)基因組中心開(kāi)發(fā))等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)資源得到有關(guān)的序列信息.b.數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)和序列的排列(alignment).數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)的軟件或網(wǎng)絡(luò)資源較多,一般常用BLAST進(jìn)行查詢(xún).對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行查詢(xún)的同時(shí)也能對(duì)序列進(jìn)行初步的排列,為后面的系統(tǒng)發(fā)育分析提供基礎(chǔ).c.系統(tǒng)發(fā)育分析(Phylogeneticanalysis).系統(tǒng)發(fā)育分析是確定微生物在發(fā)育過(guò)程中種屬關(guān)系的一種手段,其主要方法包括直接創(chuàng)建方法(基于距離評(píng)分方法)、樹(shù)查找方法(檢約法和最大可能性法)等.系統(tǒng)發(fā)育分析的原理及方法見(jiàn)文獻(xiàn).2好氧和厭氧氨氧化菌原位檢測(cè)采用FISH,PCR,DNA克隆、DNA測(cè)序和序列分析等技術(shù),對(duì)采自江蘇省新沂河、蘇州市城市河道和東太湖等不同生境條件的水體底泥樣品進(jìn)行了好氧和厭氧氨氧化菌的原位檢測(cè).2.1土壤樣品研究采集了6個(gè)底泥樣品,其特性見(jiàn)表1.2.2新沂蒙河底泥中anammox菌的原位檢測(cè)結(jié)果采用anammox菌特異性探針AMX368對(duì)所采集的6個(gè)底泥樣品進(jìn)行anammox菌的原位檢測(cè),結(jié)果表明,只有在新沂河底泥樣品XYR1和XYR2中觀察到了具有環(huán)狀形態(tài)(anammox菌區(qū)別于其他細(xì)菌的特殊形態(tài))的目標(biāo)細(xì)胞(圖2),其余底泥樣品中均未發(fā)現(xiàn)目標(biāo)細(xì)胞.系統(tǒng)發(fā)育分析表明,樣品XYR2中存在屬于Brocadia分支的anammox菌.2.3pcr產(chǎn)物的克隆在確認(rèn)新沂河樣品XYR2中確實(shí)存在anammox菌之后,對(duì)其分離后的DNA再通過(guò)引物對(duì)amoA1F(氨單氧酶亞單元A向前引物)和amoA2R(氨單氧酶亞單元A向后引物)擴(kuò)增后,對(duì)得到的PCR產(chǎn)物用PCR1.2TOPO載體進(jìn)行了克隆;然后,對(duì)挑選出的白色菌落DNA進(jìn)行分離,對(duì)其進(jìn)行消化后,用凝膠電泳檢查并選擇進(jìn)行測(cè)序的克隆DNA.共對(duì)樣品XYR2的4個(gè)amoA基因進(jìn)行了測(cè)序.對(duì)于這些amoA序列轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)后的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析