鮮切果蔬上市前檢測病原微生物的應(yīng)用

鮮切果蔬上市前檢測病原微生物的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和生活水平的提高，人們對水果的消費需求越來越高。新鮮食品作為一種便捷的營養(yǎng)食物，已成為食品加工行業(yè)的發(fā)展趨勢。鮮切果蔬(fresh-cutfruitsandvegetables)是指對新鮮果蔬進行分級、整理、清洗、切分、保鮮、包裝等處理,并使產(chǎn)品保持生鮮狀態(tài)的制品。消費者購買了鮮切果蔬后無需作進一步的處理,可直接食用或烹飪,使其具有天然、健康、方便等特點,滿足了當(dāng)今社會生活節(jié)奏快的需求,也因此深受人們青睞。由于果蔬的含水量較高,加之切割處理降低了果蔬組織自然抵抗微生物的能力,極易引起病原微生物對鮮切果蔬的侵染,從而引起致病性疾病,危害人類健康。據(jù)報道,在與新鮮農(nóng)產(chǎn)品有關(guān)的70多種食源性疾病中,有25%與鮮切農(nóng)產(chǎn)品有關(guān)。所以,病原微生物是影響鮮切果蔬安全的主要因素之一。本文就近幾年來鮮切果蔬病原微生物種類、生長特點、影響因素及快速檢測方法作一概述。1食源性微生物的寄生蟲1.1鮮切貯藏保鮮大腸桿菌O157∶H7是一種低劑量就能感染的食源性病原微生物,其具有致病性。大腸桿菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌的主要病原血清型,能夠引起人的出血性腹瀉和腸炎,且極易并發(fā)溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜,嚴(yán)重時可致人死亡。大腸桿菌O157∶H7即使是低劑量污染新鮮農(nóng)產(chǎn)品,也可以使鮮切綠葉狀蔬菜對人類造成嚴(yán)重的健康危害。Maribel等在25℃下對鮮切果蔬進行貯藏,觀察大腸桿菌的變化,研究發(fā)現(xiàn)蔬菜在貯藏3d后,鮮切胡蘿卜中的大腸桿菌比鮮切萵苣中的多;而水果中,無論是在氣調(diào)包裝中還是空氣中貯藏1d后,鮮切西瓜中大腸桿菌的數(shù)量均增加,而鮮切菠蘿中大腸桿菌的數(shù)量沒有增加。在5℃下,大腸桿菌的數(shù)量沒有增加,但仍存活在鮮切果蔬中。研究人員發(fā)現(xiàn)將大腸桿菌O157∶H7接種到鮮切萵苣上,在8℃以上,大腸桿菌O157∶H7的數(shù)量會增加。RaybaudiMassilia等用肉桂和檸檬香草精油處理鮮切富士蘋果,能夠顯著降低貯藏期間大腸桿菌O157∶H7的數(shù)量。鮮切產(chǎn)品上大腸桿菌O157∶H7的生長除了受內(nèi)在的以及外在的參數(shù)(如溫度、氣體成分等)的影響,加工的程度也會影響它的生長,比如切割的程度以及切割的方式。1.2鮮切蔬菜樣品的感染據(jù)美國疾病控制中心的統(tǒng)計,沙門氏菌是世界范圍內(nèi)第二大食源性疾病致病菌,能夠引起腹瀉、高燒,嚴(yán)重情況下會提高人類的發(fā)病率和死亡率。在西班牙坎皮納斯,從超市中隨機選取172例鮮切蔬菜樣品,其中有29例樣品被沙門氏菌所感染。到目前為止,已經(jīng)報道過4例芒果和2例木瓜暴發(fā)了沙門氏菌感染。沙門氏菌中最常見的就是鼠傷寒沙門氏菌。2008年,美國暴發(fā)的西紅柿沙門氏菌感染事件的罪魁禍?zhǔn)拙褪鞘髠抽T氏菌。研究人員發(fā)現(xiàn),在鮮切萵苣上接種鼠傷寒沙門氏菌,在4℃下沙門氏菌的數(shù)量會減少,在20℃下其數(shù)量會增加。鮮切卷心菜中的鼠傷寒沙門氏菌在8℃下沒有增長,但在10℃下數(shù)量有所增加,這是一個影響貯藏條件的臨界值。1.3單增李菌的檢測結(jié)果據(jù)記載,第一例由食品引起的李斯特菌感染發(fā)生在1981年,發(fā)生在加拿大的一次沙拉制品的較大規(guī)模的污染事件,其中有41例被感染,7例致死。田靜等對蔬菜沙拉中的單增李斯特菌進行風(fēng)險評估,發(fā)現(xiàn)在1581份樣品中,有1.52%被檢出有單增李斯特菌。單增李斯特菌是一種能引起人畜共患病的食源性致病菌,與其他食源性致病菌相比,單增李斯特菌感染相對比較少見,但比常見的沙門氏菌和大腸桿菌更為致命。由于李斯特菌可以在低溫、低水分活度、低pH、高鹽的環(huán)境中持續(xù)生長和繁殖,因此廣泛存在于自然界中,食品中存在的單增李斯特菌對人類的安全具有威脅。研究發(fā)現(xiàn),鮮切蘋果上的單增李斯特菌在5℃下仍能夠生存。將鮮切萵苣和胡蘿卜放在4℃下的氣調(diào)包裝中進行貯藏,發(fā)現(xiàn)李斯特菌不能夠生長繁殖,但能夠存活。將鮮切萵苣放在氣體比例為10%O2+10%CO2的氣調(diào)包裝中,李斯特菌沒有顯著的增長。1.4細(xì)菌致病毒血癥志賀氏桿菌是嗜溫的病原菌,當(dāng)鮮切果蔬的溫度高于10℃時,它們大部分開始生長。志賀氏桿菌是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌,只需少量病菌進入體內(nèi),就可致病,嚴(yán)重時可導(dǎo)致毒血癥。研究發(fā)現(xiàn),馬鈴薯沙拉中的志賀氏桿菌在2.5℃和8℃下數(shù)量并沒有減少。MaríaVictoriaSelma等用2ppm的臭氧水處理鮮切萵苣,發(fā)現(xiàn)其上的志賀氏菌數(shù)減少了0.9log單位。BarakatS.M.Mahmoud用1.0kGy的X-射線照射接種過志賀氏桿菌的切碎的卷心萵苣上,發(fā)現(xiàn)每5cm2切碎的卷心萵苣上,志賀氏桿菌減少4.4log單位。2化學(xué)保鮮中病原微生物的檢測1990年,美洲發(fā)現(xiàn)295例由于食用鮮切甜瓜引起的切斯特沙門氏菌感染。2000年,在威斯康星州有500多人由于食用鮮切果蔬而致病。由于鮮切果蔬易被病原微生物感染而導(dǎo)致疾病,因此檢測鮮切果蔬中的病原微生物是保障鮮切果蔬食用安全性的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的檢測技術(shù)存在耗時長、敏感性低等缺點。隨著生物技術(shù)的不斷進步和發(fā)展,對鮮切果蔬中病原微生物的快速檢測方法也在不斷的更新和完善。目前,在鮮切果蔬中應(yīng)用的病原微生物快速檢測方法主要有以下幾種。2.1pcr檢測微生物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法是在體外快速擴增特定基因或DNA序列,從而對病原微生物含量進行快速檢測。在檢測時,先將被檢微生物雙鏈DNA加熱變性為單鏈:而后在低溫情況下,人工合成的特異性引物與互補的單鏈DNA結(jié)合;在TaqDNA酶的最適溫度下,引物沿模板以5’→3’方向延伸,自動合成新的DNA雙鏈。新合成的DNA雙鏈又可作為擴增的模板,繼續(xù)重復(fù)以上的DNA多聚酶鏈反應(yīng),擴增得到大量的被檢微生物DNA,最后一般在凝膠電泳下檢測目的DNA。PCR技術(shù)具有快速、精確、特異性高、成本低等優(yōu)點,起初用于基因克隆和轉(zhuǎn)基因檢測方面,現(xiàn)今已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域。直到近幾年,PCR技術(shù)才廣泛應(yīng)用到食品安全檢測中。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展,再加之與其他技術(shù)相結(jié)合,現(xiàn)衍生出許多優(yōu)良的PCR技術(shù),如實時定量PCR(real-timePCR,RT-PCR)、熒光定量PCR、多重PCR等。Yun-JiKim等建立了大腸桿菌O157∶H7的RT-PCR檢測方法,其中檢測限達(dá)到1.53logCFU·mL-1,操作時間為2h。GSánchez等建立了大腸桿菌O157∶H7、李斯特菌、沙門氏菌的RT-PCR檢測方法,檢測限分別為103、102、103CFU/g,并且發(fā)現(xiàn)這種方法可同時檢測鮮切蔬菜上兩種類型的食源性致病菌。PatriciaElizaquível等研究發(fā)現(xiàn),對于檢測和定量鮮切蔬菜上的病原微生物,疊氮溴化丙錠(PMA)與PCR技術(shù)相結(jié)合的方法是可行的。目前,也已經(jīng)有報道針對大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的多重PCR方法。2.2酶聯(lián)免疫法檢測鮮切果蔬中的病原菌微生物從20世紀(jì)80年代中后期開始,就有人運用該法進行了有關(guān)食品中病原微生物快速檢測的研究。酶聯(lián)免疫法可檢測鮮切果蔬中常見的大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌等病原微生物。酶聯(lián)免疫法具有檢測速度快、靈敏性高、特異性強、結(jié)果定量等優(yōu)點。Kang等曾采用ELISA間接法測定大腸桿菌O157∶H7。葛俊偉等建立了利用重組李氏桿菌溶血素(LLO)檢測單增李斯特菌的ELISA方法。2.3生物熒光素和atp的氧化機理ATP生物發(fā)光法主要是通過測定溶液中ATP的量來間接測定活菌總數(shù),從而能夠檢測樣品的衛(wèi)生狀況。其原理是利用細(xì)菌細(xì)胞裂解時釋放出的三磷酸腺苷(ATP),在有氧的情況下,螢火蟲熒光素和ATP在螢火蟲熒光素酶的催化下發(fā)生氧化反應(yīng)而形成氧化熒光素并發(fā)出熒光。在一個反應(yīng)中,當(dāng)螢火蟲熒光素酶和螢火蟲熒光素過量時,ATP的量通過熒光的強度來表示,細(xì)菌中ATP的量與細(xì)菌數(shù)成正相關(guān),從而推斷出菌落總數(shù)。用ATP生物發(fā)光技術(shù)可以檢測鮮切果蔬細(xì)菌污染狀況能夠達(dá)到快速適時的目標(biāo)。ATP生物發(fā)光法曾用于檢測鮮切瓜中的微生物。ATP生物發(fā)光法檢測快速,每次檢測微生物ATP的時間可以控制在幾分鐘之內(nèi),操作簡便,靈敏度高,適合在鮮切果蔬安全檢測中進行推廣應(yīng)用。2.4熒光定量技術(shù)熒光原位雜交(FISH)是一種通過特定分子的熒光標(biāo)記探針與染色體上特意的互補核酸序列原位雜交,通過激發(fā)雜交探針的熒光來檢測信號,從而進行定性和相對定量分析。該技術(shù)具有高度的敏感性、定位準(zhǔn)確、快速等特點而廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域。YolandaMoreno等用DVC-FISH技術(shù)對191個蔬菜樣品(其中包括新鮮蔬菜、冷凍蔬菜、氣調(diào)包裝下的鮮切蔬菜)進行單增李斯特菌的檢測,檢測出32.98%的樣品中含有單增李斯特菌,此技術(shù)用于快速檢測單增李斯特菌是可行的。2.5電導(dǎo)性培養(yǎng)基檢測全自動微生物檢測系統(tǒng)是一種以電阻抗原理為基礎(chǔ)的快速檢測和計數(shù)微生物的系統(tǒng)。在培養(yǎng)微生物的過程中將電惰性底物轉(zhuǎn)化為電活性產(chǎn)物,從而降低培養(yǎng)物的阻抗,微生物的數(shù)量可以通過檢測培養(yǎng)基中的電導(dǎo)性變化來表示。檢測樣品中的菌落總數(shù)、乳酸菌、大腸菌群和霉菌等可以根據(jù)需要選擇不同的培養(yǎng)基來實現(xiàn),檢測菌落總數(shù)和大腸菌群可以在24h之內(nèi)完成,并且污染越嚴(yán)重,檢測越迅速,甚至幾個小時就能出結(jié)果。該系統(tǒng)能夠明顯節(jié)省時間、人力和物力,要優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。法國生物梅里埃集團生產(chǎn)的VIDAS全自動快速致病菌篩選系統(tǒng)能檢測沙門氏菌、大腸桿菌等常見的致病菌。2010年,我國廣東省對沙拉中食源性致病微生物進行檢測時所采取的是熒光定量PCR方法與mini-VIDAS全自動熒光檢測相結(jié)合的方法。3不同快速檢測技術(shù)聯(lián)用的檢測結(jié)果鮮切果蔬是一種能夠保持水果、蔬菜原有風(fēng)味和品質(zhì)的生鮮食品,具有呼吸代謝等生命活動,在加工、貯藏過程中極易被食源性病原微生物感染而給消費者帶來危害。鮮切果蔬中的病原微生物污染與消費者的健康息息相關(guān),因此,在鮮切果蔬上市