微生物菌種的篩選、誘變與保存技術(shù)

微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)第四章微生物菌種的保藏、篩選及誘變技術(shù)

微生物菌種的保藏、篩選及誘變技術(shù)

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育實(shí)驗(yàn)4-2紫外線誘變育種實(shí)驗(yàn)4-3微生物菌種的保藏方法實(shí)驗(yàn)4-4蘇云金桿菌的蟲體復(fù)壯實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)從含酚工業(yè)污水、活性污泥中篩選苯酚降解菌。

2.學(xué)習(xí)通過活性污泥馴化分離耐酚菌。二、實(shí)驗(yàn)原理酚類化合物是化工、造紙、鋼鐵等工業(yè)廢水的主要有害成分，含酚污水的排放，污染水源、毒死魚蝦、危害莊稼、嚴(yán)重危害人類健康，是各國研究關(guān)注的污染物之一。含酚廢水中分離出的生物降解酚能力強(qiáng)的菌為：假單胞菌、白乳桿菌、假絲酵母和野絲膜菌等。含酚廢水生物處理目前主要采用活性污泥法。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌源含酚工業(yè)廢水或含酚廢水曝氣池中的活性污泥。

2.培養(yǎng)基耐酚真菌培養(yǎng)基(固體、液體和斜面)，耐酚細(xì)菌培養(yǎng)基(固體、液體和斜面)，碳源對(duì)照培養(yǎng)液a，苯酚培養(yǎng)液b，見附錄Ⅲ。

3.試劑2%4-氨基安替比林溶液，8%鐵氰化鉀溶液，氯仿，氨性氯化銨緩沖液，溴酸鉀-溴化鉀溶液，硫代硫酸鈉溶液,1%淀粉溶液，（見附錄Ⅴ）。

4.其他稀釋分離所用的無菌水，無菌培養(yǎng)皿，無菌移液管，測(cè)定酚所用的移液管，容量瓶，試劑瓶，酸式滴定管等。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育四、實(shí)驗(yàn)方法

1.采樣自焦化廠、鋼鐵公司化工廠、造紙廠處理含酚工業(yè)污水的曝氣池中取活性污泥和含酚污水，裝于無菌瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室，記錄采樣日期、地點(diǎn)，曝氣池的水質(zhì)分析包括：揮發(fā)酚、可溴化物、BOD5五日生化需氧量、COD化學(xué)需氧量、焦油、硫化物、氰化物、總氮、氨態(tài)氮、磷、pH、水溫等。采集的樣品應(yīng)迅速稀釋分離。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育

2.分離純化梯度平板制備：在無菌培養(yǎng)皿中，先傾倒7～l0mL不含苯酚的無菌細(xì)菌或真菌固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)皿一側(cè)置于木條上，使皿中培養(yǎng)基傾斜成斜面，且剛好完全蓋住培養(yǎng)皿底部，待培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)皿放平，再倒入無菌7～l0mL(剛好完全蓋住下層斜面)含70mL/l00mL苯酚的無菌耐酚細(xì)菌或耐酚真菌固體培養(yǎng)基，剛好完全蓋住下層斜面，放置過夜。由于苯酚的擴(kuò)散作用，造成上層培養(yǎng)基由厚到薄的藥物濃度遞減的梯度(圖4-1)。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育圖4-1梯度平板

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育涂布法分離：將采集的樣品按涂布法分離，30℃培養(yǎng)2天后，平板上生長的菌落也形成密度梯度，苯酚低濃度區(qū)形成菌苔，苯酚高濃度區(qū)出現(xiàn)稀少菌落，將此菌落在含耐酚細(xì)菌或真菌培養(yǎng)基平板上連續(xù)劃線分離，最后挑取單菌落接種到耐酚斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2天。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育

3.耐酚菌馴化先將從含酚廢水采集的活性污泥放入含酚量小于l00mg/L含酚廢水中，添加0.3%MgSO4·7H2O、0.3%KH2PO4，30℃振蕩培養(yǎng)6～7天，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰對(duì)酚不適應(yīng)的微生物；再流加含酚廢水，使苯酚濃度增加至200mg/L，30℃振蕩培養(yǎng)4～6天；再提高到流加250mg/L含酚廢水，30℃培養(yǎng)4天，從中選出對(duì)酚耐受力強(qiáng)的菌株。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育

4.性能測(cè)定。初篩：制備不同含酚濃度的耐酚平板培養(yǎng)基，苯酚濃度為0.025%、0.045%、0.060%、0.075%，將選出的耐酚力強(qiáng)的的菌株在以上平板培養(yǎng)基上劃線分離，自高酚濃度平板上長出的菌落，即為酚降解力高的菌株。復(fù)篩：將初篩純化的菌種分別接入碳源對(duì)照培養(yǎng)液a和苯酚培養(yǎng)液b中，30℃振蕩培養(yǎng)48h，0、12、24、36、48h取樣測(cè)A600光密度值，繪制生長曲線，以不含酚的碳源(葡萄糖)培養(yǎng)液為對(duì)照。若與對(duì)照相比，在250mg/L苯酚濃度培養(yǎng)液中生長速度下降不明顯，同時(shí)，用4-氨基安替比林法檢測(cè)發(fā)酵初時(shí)發(fā)酵液和發(fā)酵終止時(shí)發(fā)酵液苯酚濃度，計(jì)算降解率，若苯酚降解率達(dá)>80%，表明確系分離到有效苯酚降解菌。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1．記錄分離得到的苯酚降解菌情況于表4-1。

2．根據(jù)復(fù)篩耐酚試驗(yàn)，繪制對(duì)照組與試驗(yàn)組生長曲線。

3．記錄在平板上和顯微鏡下觀察的苯酚降解菌的菌落特征和鏡檢特征。

實(shí)驗(yàn)4-1降解苯酚微生物的選育表4-1苯酚降解菌株的降解率菌源菌株不同酚濃度平板生長狀況0.025%0.045%0.060%0.075%菌源菌株苯酚降解率﹤70%71%～80%81%～90%91%～100%返回實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．掌握紫外線誘發(fā)微生物突變的基本原理。

2．學(xué)習(xí)篩選、檢出和鑒定營養(yǎng)缺陷型突變株的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)以紫外線作為誘變因素，照射時(shí)間為60s，用青霉素法將缺陷型進(jìn)行濃縮。再根據(jù)營養(yǎng)缺陷型在基本培養(yǎng)基上不能生長，只能在完全培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基中加有它所缺陷的那種物質(zhì)才能生長的原理，采用逐個(gè)點(diǎn)種法，將營養(yǎng)缺陷型檢出，然后用生長譜法將缺陷型加以鑒定。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種野生型大腸桿菌（E.coli）。

2.培養(yǎng)基肉湯液體培養(yǎng)基，加倍肉湯液體培養(yǎng)基(2E)，固體完全培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基(固體)，無N基本液體培養(yǎng)基，2N基本液體培養(yǎng)基，見附錄Ⅲ。

3.生長因子類別混合氨基酸和混合維生素的配制（若所用氨基酸為DL型，量需加倍），共分八組（見表4-2）.４.器材培養(yǎng)皿(9cm、6cm)，三角瓶(150mL)，lmL吸管，10mL吸管，離心管(10mL)，帶15W紫外燈管照射裝置，離心機(jī)等。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

表4-2混合氨基酸和混合維生素的配制I賴精甲硫半胱胱嘌II組精蘇谷天冬嘧Ⅲ丙甲硫蘇羥脯甘絲Ⅳ亮半胱價(jià)羥脯異亮纈Ⅴ苯丙胱天冬甘異亮酪Ⅵ色嘌嘧纈酪Ⅶ脯Ⅷ混合維生素（含多種常用維生素）實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.誘變處理（1）實(shí)驗(yàn)前14～16h挑取野生型大腸桿菌1環(huán)于盛有5mL肉湯的三角瓶中，置37℃培養(yǎng)過夜。（2）第2天添加5mL新鮮的肉湯培養(yǎng)液，充分混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)5h。（3）取5mL培養(yǎng)好的溶液倒入離心管中，離心(3500r/min，10min)。（4）倒去上清液，打勻沉淀，吸入5mL生理鹽水，制成菌懸液。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

（5）吸上述菌液3mL于直徑為6cm的小培養(yǎng)皿內(nèi)(皿內(nèi)放一攪拌子，下為磁力攪拌器)，將培養(yǎng)皿放在15W的紫外光燈下，距離28.5cm。（6）處理前先開紫外燈穩(wěn)定10min以上，將待處理的培養(yǎng)皿連蓋放入燈下滅菌lmin，然后開蓋在攪拌條件下處理lmin，照射后蓋上皿蓋，再關(guān)紫外燈。（7）吸3mL加倍肉湯培養(yǎng)液倒入處理后的培養(yǎng)皿中，放置在37℃溫箱內(nèi)，避光培養(yǎng)12h以上。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

2.用青霉素法淘汰野生型（1）吸5mL處理過的菌液于已滅菌的離心管，離心10min(3500r/min)。（2）倒去上清液，打勻沉淀，加入生理鹽水，離心洗滌3次，吸生理鹽水到原體積。（3）吸取經(jīng)離心洗滌的菌液0.1mL于5mL無N基本培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)12h。（4）培養(yǎng)12h后，按1∶1加入2N基本培養(yǎng)液5mL，稱取青霉素鈉鹽，使青霉素在菌液中的最終濃度約為500u/mL，再放入37℃溫箱中培養(yǎng)。（5）從培養(yǎng)12，16，24h的菌液中，各取0.1mL菌液到預(yù)先倒好的基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基的平板中涂皿。放入37℃溫箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

3.缺陷型的檢出（1）以上平板培養(yǎng)36～48h后，進(jìn)行菌落計(jì)算，選用完全培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)大大超過基本培養(yǎng)的那一組，用無菌牙簽挑取完全培養(yǎng)基上長出的菌落100個(gè)，分別點(diǎn)種于基本與完全培養(yǎng)基平板上，先基本后完全，于37℃溫箱培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)12h后，選在基本培養(yǎng)基上不長，完全培養(yǎng)基上生長的菌落，在基本培養(yǎng)基的平板上劃線復(fù)證。37℃溫箱培養(yǎng)，24h后不生長的可能是營養(yǎng)缺陷型，便可用于鑒定。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

4.生長譜鑒定（1）將可能是缺陷型的菌落接種于盛有5mL肉湯培養(yǎng)液的離心管中，37℃培養(yǎng)14～16h。（2）培養(yǎng)16h后，以3500r/min離心l0min，倒去上清液，打勻沉淀，然后離心洗滌三次，最后加生理鹽水到原體積。（3）吸取經(jīng)離心洗滌的菌液lmL于滅菌的培養(yǎng)皿中，然后倒入熔化后冷至40～50℃的基本培養(yǎng)基，搖勻放平，待凝，共做兩皿。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

（4）將兩只培養(yǎng)皿的皿底，等分8格，依次放入混合氨基酸，混合維生素和核酸堿基混合物，然后放入37℃溫箱培養(yǎng)24～28h。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程參見圖4-2。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告觀察生長圈，確定是哪種營養(yǎng)缺陷型。實(shí)驗(yàn)4-2利用紫外線誘變篩選營養(yǎng)缺陷型突變株

圖4-2紫外線誘變篩選大腸桿菌營養(yǎng)缺陷型突變株流程圖返回實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠⒄莆站N保藏的常用方法、基本原理及其應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理菌種保藏的原理是微生物在低溫、干燥、缺氧的條件下會(huì)降低代謝活動(dòng)，使細(xì)胞處于休眠和代謝停滯狀態(tài)，從而能夠較長期地保藏菌種，并能推遲細(xì)胞退化，降低菌種的變異率。常用的保藏方法包括斜面?zhèn)鞔２胤?、穿刺保藏法、液體石蠟保藏法、砂土管保藏法等。這些方法操作簡便易行，不需要特殊設(shè)備，為一般實(shí)驗(yàn)室及生產(chǎn)單位廣泛采用。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

三、實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌斜面菌種。

2.培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏1號(hào)培養(yǎng)基，馬丁氏培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。

3.試劑10%HCl，篩子，無水氯化鈣，醫(yī)用液體石蠟（比重0.83～0.89），河沙，瘦黃土（含有機(jī)物少的黃土）。

4.器材干燥器，40目及100目無菌篩子，無菌試管，無菌移液管（1mL及5mL），接種環(huán)，接種針，無菌滴管，超凈工作臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.砂土管保藏法此法僅適用于保藏產(chǎn)生芽孢或孢子的微生物，常用于保藏芽孢桿菌、梭菌、放線菌或霉菌等。

(1)無菌砂土管制備①河砂處理取河砂1000～1500g，用40目篩子過篩，除去大的顆粒。再用10%HCl溶液浸泡，除去有機(jī)雜質(zhì)，鹽酸用量應(yīng)浸沒砂面，約浸泡24h，倒出鹽酸，用自來水沖洗至中性，烘干。用磁鐵石除去黃砂中的鐵質(zhì)。②篩土取30cm以下的較貧瘠非耕作層的黃土若干，自來水沖洗至中性，烘干磨細(xì)，用100目篩子過篩。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

③砂和土混合砂和土以1∶1或3∶2混合均勻，裝入100mm×10mm小試管中。裝量約1cm高即可，塞上棉塞，包上牛皮紙。④滅菌高壓蒸汽滅菌，121℃滅菌1～1.5h。每天一次，連續(xù)滅3d。在50℃以下烘干。⑤無菌檢查取滅菌后的砂土少許，接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)1～2d，觀察有無雜菌生長。如有，則需重新滅菌。實(shí)驗(yàn)４-３微生物菌種的保藏方法

（2）制備菌懸液首先使斜面菌體生長健壯，孢子飽滿，吸取3～5mL無菌水至1支已培養(yǎng)待保藏的菌種斜面中，用接種環(huán)輕輕刮下孢子或菌苔（注意不要帶入菌絲和培養(yǎng)基），使成菌懸液，細(xì)胞濃度為108～1010mL-1。（3）加樣用無菌吸管吸取菌懸液，在每支砂土管中滴加4～5滴菌懸液，用接種環(huán)拌勻，塞上砂土管棉塞。（