產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展

產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展

產(chǎn)前診斷是預(yù)防兒童缺陷和優(yōu)秀兒童的重要手段。據(jù)統(tǒng)計,國外胎兒畸形的發(fā)病率約15‰左右,國內(nèi)發(fā)病率約為13.7‰左右,這些數(shù)據(jù)表明婦產(chǎn)科學(xué)迫切地需要先進產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展。近年來,分子生物學(xué)技術(shù)在染色體疾病方面的不斷研究進展,使得產(chǎn)前診斷技術(shù)得到了發(fā)展。1胎兒染色體異常風(fēng)險的篩查適用于產(chǎn)前診斷技術(shù)的人群包括:(1)≥35歲的孕婦;(2)產(chǎn)前篩查結(jié)果為胎兒染色體異常高風(fēng)險的孕婦;(3)曾生育過染色體病患兒的孕婦;(4)產(chǎn)前超聲檢查懷疑胎兒有染色體異常的孕婦;(5)夫妻一方為染色體異常攜帶者;(6)醫(yī)師認為的有必要進行產(chǎn)前診斷的其他情況。2產(chǎn)前診斷方法及研究現(xiàn)狀2.1創(chuàng)性產(chǎn)前診斷2.1.1通過染色體核型分析獲取胎兒組織標(biāo)本早在20世紀(jì)60年代,醫(yī)生就通過羊水細胞的檢查來診斷遺傳性疾病。1966年Steel和Breg發(fā)現(xiàn)可以通過對羊水細胞的培養(yǎng)進行染色體核型分析對胎兒進行產(chǎn)前診斷,Jacobson和Barter在1967年首次對1例染色體異常的胎兒進行了產(chǎn)前診斷。當(dāng)今通過羊膜腔穿刺術(shù)對羊水中胎兒脫落細胞培養(yǎng)以及染色體核型分析用來檢測胎兒染色體是否異常,是目前產(chǎn)前診斷中獲取胎兒組織標(biāo)本最主要的方式,是唐氏綜合征(Downsyndrome,DS)產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。羊膜腔穿刺術(shù)最佳采樣時間為妊娠第17~21周。2.1.2睪丸染色的制備以宮腔內(nèi)吸管負壓吸取法應(yīng)用最為廣泛,1970年中國鞍鋼鐵東醫(yī)院開展妊娠早期胎兒性別預(yù)測時首創(chuàng)盲吸法。在此基礎(chǔ)上,英國Gosden(1982年)、Old(1982年)、Branbati等(1983年)在B超顯像下找準(zhǔn)胎盤絨毛處,取材的成功率>90%。1985年1月Jackson統(tǒng)計世界上46個單位已用此法做了絨毛取材4054例,成功率>97%。1983年Simoni等用此法取到絨毛后不經(jīng)培養(yǎng),用直接法制備染色體進行產(chǎn)前診斷并獲得成功,為《醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)》作出了貢獻。絨毛采樣最佳時間為妊娠第9~12周,用于絨毛細胞染色體的制備。現(xiàn)今,隨著科學(xué)技術(shù)的逐步發(fā)展,取絨毛的方法也逐步變得簡單化,創(chuàng)傷小,流產(chǎn)率低,減少孕婦的心理壓力。2013年江門市中心醫(yī)院檢驗科細胞遺傳室的謝志威等對符合產(chǎn)前診斷指征的孕婦于早孕期(孕7~13周)行腹部超聲引導(dǎo)下取絨毛組織進行培養(yǎng),取得良好的效果。2.1.3產(chǎn)前診斷技術(shù)在1983年Daffos利用超聲掃描經(jīng)孕婦腹壁直接穿刺臍血管獲取胎兒血標(biāo)本以做產(chǎn)前診斷,從此臍血管穿刺術(shù)得到了發(fā)展成為一種產(chǎn)前診斷方法,極大提高了產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性。用于胎兒血細胞培養(yǎng)制備染色體,是妊娠晚期常用的檢測樣本,除用于染色體病的診斷外,主要用于胎兒血紅蛋白病的診斷。方法為超聲引導(dǎo)下穿刺胎兒臍帶取血,此法能校正羊水細胞、絨毛細胞培養(yǎng)出的假嵌合體,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。陳錚等證實超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹臍血管穿刺抽取臍血在產(chǎn)前診斷中是較成熟有效的操作技術(shù)。夫妻雙方有染色體異常的是進行產(chǎn)前診斷的重要指征。2.1.4遺傳檢測及手術(shù)時機選擇此方法是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與顯微操作技術(shù),在受精卵分裂為8細胞左右時取出1~2個細胞,進行特定的遺傳學(xué)性狀檢測,然后據(jù)此選擇合適的囊胚進行胚胎移植技術(shù)。遺傳學(xué)性狀的檢測方法以熒光原位雜交技術(shù)(FISH)或各種PCR(polymerasechainreaction)技術(shù)為主,目前常用于某些單基因疾病、染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常以及性連鎖性遺傳病的攜帶者等有可能分娩遺傳性疾病后代的高危夫婦的胚胎選擇。該技術(shù)的主要目的與治療不孕癥無關(guān),但以輔助生殖技術(shù)為基礎(chǔ),應(yīng)用PGD技術(shù)可以避免反復(fù)的選擇性流產(chǎn)或引產(chǎn)和遺傳性疾病患兒的出生。2.1.5胎兒鏡的適應(yīng)證1974年HobbinS等在局部麻醉下經(jīng)皮膚和腹腔進入子宮腔首獲成功。國外采用的胎兒鏡是用直徑0.5~2mm的纖細光纖內(nèi)鏡通過孕婦腹壁進入羊膜腔觀察胎兒,進行各種相關(guān)檢查或者進行必要的治療,一般建議在孕第18周后進行手術(shù),目前主要應(yīng)用于細胞或(及)分子遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷的孕婦。胎兒鏡是一種很細的光學(xué)纖維內(nèi)窺鏡,它能夠觀察孕婦的羊水環(huán)境及胎兒外形,并且可以抽取臍帶血或獲取胎兒組織進行活檢的結(jié)果用做產(chǎn)前診斷,還可借助胎兒鏡用于宮內(nèi)治療。但胎兒鏡檢查可能導(dǎo)致胎膜早破、母體肺水腫及臟器損傷、羊水滲出、胎盤及胎兒損傷、流產(chǎn)、早產(chǎn)等并發(fā)癥,因此臨床應(yīng)用中應(yīng)嚴(yán)格掌握其適應(yīng)證。近年來,國內(nèi)已有醫(yī)院陸續(xù)開展了胎兒鏡的檢查和治療,并取得了較好的效果。2.2無創(chuàng)產(chǎn)前診斷2.2.1超聲檢查檢查用于胎兒結(jié)構(gòu)的檢查,超聲影像學(xué)檢查是最常用的檢查方法,包括B超二維成像、三維成像、實時三維成像、彩色血流多普勒、脈沖多普勒等,對篩查懷疑得到胎兒結(jié)構(gòu)異常進一步檢查,孕18~20周行產(chǎn)前超聲檢查能診斷出大部分胎兒結(jié)構(gòu)畸形。2.2.2規(guī)范工作時間由于傳統(tǒng)的胎兒細胞染色體核型分析需要對取材后的胎兒細胞進行培養(yǎng),通常需要7~10天時間收獲、分析處于分裂中期的細胞。工作流程相對復(fù)雜,對工作人員資質(zhì)有一定的要求,故從取材至報告需要的時間較長,目前我國衛(wèi)生部行業(yè)規(guī)范要求28個工作日發(fā)出報告,這給等待結(jié)果的孕婦及其家人帶來較大困擾,長時間處在比較焦慮的狀態(tài),快速產(chǎn)前診斷應(yīng)運而生?？焖佼a(chǎn)前診斷不需要培養(yǎng),針對間期的胎兒細胞操作及閱片過程相對簡單,大大縮短了報告時間。但目前較為常用的方法包括以下多種技術(shù)。2.2.2.在胚胎停育和染色體核型分析中的應(yīng)用FISH是一種為遺傳病診斷提供更為直觀、快速診斷的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù),隨著DNA技術(shù)的發(fā)展與染色體特異性探針的出現(xiàn),FISH技術(shù)越來越多的應(yīng)用于生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床診斷。FISH是利用標(biāo)記的DNA探針在一個特定序列進行雜交以檢測靶片斷,它只需根據(jù)雜交位點數(shù)目即可迅速確定染色體數(shù)目,檢測時間明顯縮短,可在24~48h內(nèi)得出結(jié)果。張寧等應(yīng)用FISH技術(shù)對停育胚胎的絨毛染色體數(shù)目異常進行快速檢測并評估其臨床應(yīng)用價值,對研究胚胎停育提供一個全新的檢測手段。張霞等發(fā)現(xiàn)FISH技術(shù)能快速準(zhǔn)確檢測染色體非整倍體異常,但不能完全替代染色體核型分析。張建芳等研究提出了對大孕周孕婦采用改良后的羊水細胞培養(yǎng)和染色體制備技術(shù)聯(lián)合FISH方法,提高了產(chǎn)前診斷成功率和效率,并具有快速、可靠、簡便等優(yōu)點。張麗芳等證實染色體三體兒的產(chǎn)生與母親年齡有關(guān)。2.2.2.產(chǎn)前診斷技術(shù)QF-PCR技術(shù)自1993年首次被應(yīng)用于唐氏綜合征的產(chǎn)前診斷以來,已被越來越多的研究證實,其在快速產(chǎn)前診斷常見非整倍體中具有快速、準(zhǔn)確、可行及簡便、經(jīng)濟等優(yōu)點,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于國外多個產(chǎn)前診斷中心,一些產(chǎn)前診斷中心已經(jīng)將QF-PCR的陽性結(jié)果作為終止妊娠的指征。PCR技術(shù)作為快速且先進的分子遺傳學(xué)診斷方法,通過對病毒核酸的檢查用于宮內(nèi)病毒感染的診斷,具有較高的敏感性和特異性,在產(chǎn)前診斷中有助于做出快速、正確的臨床決策。宋花蕾等探討光譜核型分析(spectralkaryotyping,SKY)結(jié)合FISH及傳統(tǒng)核型分析技術(shù)在產(chǎn)前診斷標(biāo)記染色體及復(fù)雜染色體畸變中的應(yīng)用,成功地對產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記染色體和畸變病例進行分析,確定了標(biāo)記染色體的來源以及復(fù)雜性染色體畸變的性質(zhì),結(jié)合超聲波檢查結(jié)果,對臨床咨詢起到了很好的指導(dǎo)作用。劉娜證實了QF-PCR用于診斷性染色體數(shù)目異常的精確性。嚴(yán)達剛等的研究表明PCR技術(shù)利用孕婦血漿中游離DNA檢測胎兒ABO血型可行、結(jié)果可靠,對診斷和預(yù)防母嬰ABO血型不合所致溶血病的發(fā)生具有重要意義。吳蘋等的論著,建立一種快速檢測DS的雙色競爭性熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(dual-colorcompetitivequantitativefluorescentpolymerasechainreaction,DCC-QF-PCR)方法,并探討其應(yīng)用于DS產(chǎn)前診斷的可能性;結(jié)論:DCC-QF-PCR具有準(zhǔn)確、快速、需模板量少和費用低廉等特點,該方法在DS的基因診斷和產(chǎn)前基因診斷中有較為廣泛的應(yīng)用前景。2.2.2.pris技術(shù)PRINS技術(shù)是繼原位標(biāo)記(PCR)之后創(chuàng)建的分子細胞生物學(xué)新技術(shù),PRlNS將PCR的敏感性與FISH的特異性相結(jié)合,在產(chǎn)前診斷染色體非整倍體疾病方面具有快遺、準(zhǔn)確、簡便的特點。1991年KochJ等對PRINS技術(shù)做出了進一步的完備,觀測實驗結(jié)果表明標(biāo)記DNA串聯(lián)重復(fù)序列的實驗時間縮短為30min;1995年Koch等又應(yīng)用PRINS技術(shù)標(biāo)記了除6、19、20號以外的其他人類染色體,檢測出了單倍體、三倍體、四倍體等染色體疾病。此后,Mennicke等、劉楊等均證實了將PRINS技術(shù)用于產(chǎn)前診斷的可靠性。在此基礎(chǔ)上,Gadji等將多重引物原位(multi-PRINS)應(yīng)用于非整倍體的診斷,進一步促進了PRINS技術(shù)的發(fā)展。2.2.2.染色體核型分析SKY技術(shù)是將FISH技術(shù)與光譜技術(shù)相結(jié)合,從而建立起來的一種新的染色體核型分析技術(shù)。經(jīng)過研究表明SKY應(yīng)用于產(chǎn)前診斷具有快速、直觀、靈敏度高等特點,可以準(zhǔn)確地對妊娠結(jié)局進行評估。廖燦等研究表明SKY技術(shù)可以快速、直觀和準(zhǔn)確地診斷不明來源的標(biāo)記染色體。2.2.2.熒光顯微鏡檢測與微陣列比較基因組雜交(array-CGH)技術(shù)CGH是在FISH基礎(chǔ)上建立的一種分子細胞遺傳學(xué)技術(shù),基本原理是將待測組織DNA和正常對照組DNA分別用不同顏色的熒光標(biāo)記,然后以一定比例將兩種DNA混合雜交后用熒光顯微鏡檢測。LeCaignecC等通過arrayCGH技術(shù)準(zhǔn)確地檢測了單獨1個細胞的染色體失衡,檢測出小到34Mb的缺失,并且同時證實了可做非整倍體檢測的單一細胞來源于早期胚胎,為單一細胞遺傳分析提供了技術(shù)方法。2.2.2.pcr檢測轉(zhuǎn)變細胞的染色體數(shù)目多重連接探針擴增技術(shù)由Schouten等在2002年首次應(yīng)用,是一種靈敏度極高的相對定量技術(shù),它以PCR為基礎(chǔ),針對染色體上的特定序列設(shè)計若干對探針,每對MLPA探針包括一長一短的兩條熒光標(biāo)記的寡核苷酸(包括脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA內(nèi)的核苷酸),這些寡核苷酸將被雜交到靶序列上相鄰的位點,通過一對能與所有長短寡核苷酸上具有同樣序列結(jié)合的普遍引物進行PCR,最后將所有延伸所獲得的產(chǎn)物通過毛細管電泳進行分離并且同時按照其填充序列的長度,并通過圖譜上不同產(chǎn)物峰的相對面積來判別其染色體數(shù)目的變化。多重連接探針擴增技術(shù)將不同的染色體之間數(shù)目的比例變更為不同雜交探針數(shù)目的比例,并通過PCR技術(shù)擴大以及增加將這種比例的改變進行無限倍數(shù)的放大。與QF-PCR法相比,MLPA消除了由于不同引物擴大以及增加效率的不同而引發(fā)的誤差,同時也大幅度提升了結(jié)果的正確率,該技術(shù)可由探針信號的異常模式檢測出染色體的三體型,一些嵌合體病疫以及結(jié)構(gòu)染色體的畸形結(jié)構(gòu)也能檢出,這是產(chǎn)前診斷技術(shù)發(fā)展的又一項重大的突破。2.2.2.bacs-單位檢測染色體核型BACs-on-Beads技術(shù)是最新發(fā)展的一項既經(jīng)濟、又快速且高效地檢測出染色體異常的染色體分子核型分析技術(shù)。BACs-on-Beads技術(shù)能成功地檢測出染色體核型,分析正常的染色體的微小缺損以及超聲顯示下無異常表現(xiàn)出的染色體合并異常結(jié)構(gòu),是目前其他非整倍體異常診斷技術(shù)無法實現(xiàn)的技術(shù),BACs-on-Beads技術(shù)也許可以取替當(dāng)今盛行的FISH技術(shù)。目前BACs-on-Beads技術(shù)正處于起始進程,它的發(fā)展將為經(jīng)濟且高效能的分子核型分析技術(shù)提供極速進展的有力條件。3與產(chǎn)前診斷相關(guān)的基因隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)不斷發(fā)展,尤其是幾種快速產(chǎn)前診斷技術(shù)日益改進給產(chǎn)前診斷領(lǐng)域帶來了巨大的應(yīng)用和發(fā)展空間。FISH技術(shù)是傳統(tǒng)細胞染色體顯帶技術(shù)的一種補充,它不可能完全代替常規(guī)的染色體顯帶技術(shù),但是隨著探針制備以及標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展,利用探針會逐漸增多,FISH技術(shù)也必將成為產(chǎn)前診斷染色體疾病重要手段之一。SKY技術(shù)不僅具有FISH技術(shù)的高特異性及高敏感性的特點,而且還有染色體核型分析的整體性,是產(chǎn)前診斷新技術(shù),在診斷標(biāo)記染色體病例上具有直觀、快速、準(zhǔn)確的特點,是目前診斷標(biāo)記染色體最好的方法,SKY技術(shù)對標(biāo)記染色