砂巖性砂性真菌的質(zhì)量評(píng)價(jià)

砂巖性砂性真菌的質(zhì)量評(píng)價(jià)

砂仁是姜科植物陽春砂、綠殼砂和海南砂的干燥成熟果實(shí)。具有除濕、益氣、止吐、理氣、安胎的功效。主要用于氣滯、脾虛、氣滯、脾虛、嘔吐、氣滯、妊娠、焦慮等疾病的治療。砂仁主含揮發(fā)油,油中主要有效成分為乙酸龍腦酯?，F(xiàn)代研究證明砂仁行氣止痛、溫脾止瀉、安胎的有效部位為揮發(fā)油,與乙酸龍腦酯密不可分。采用β-環(huán)糊精包合砂仁揮發(fā)油及其主要有效成分乙酸龍腦酯,既可以有效避免砂仁揮發(fā)油因逸散流失導(dǎo)致的療效降低和藥材資源浪費(fèi),有利于中醫(yī)藥的可持續(xù)發(fā)展;又可將液體的砂仁揮發(fā)油制備成固體分散狀態(tài)的β-環(huán)糊精包合物,提高了制劑的穩(wěn)定性和療效,有利于砂仁制劑高效、速效地發(fā)揮臨床療效,充分體現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代新制劑的特色。目前國(guó)內(nèi)外在制定揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí),通常只考察揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物收得率。本課題力圖建立一套砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)體系:以砂仁揮發(fā)油主要有效成分乙酸龍腦酯-β-環(huán)糊精包合率為主要質(zhì)控指標(biāo),以砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物收得率為輔助質(zhì)控指標(biāo),綜合評(píng)價(jià)砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物的質(zhì)量。為豐富和完善揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一種新的思路和方法。1藥物、試劑和試劑GX-300A氮、氫、空三氣一體發(fā)生器(北京市中興科技發(fā)展有限公司),GC112A氣相色譜儀(上海分析儀器廠),FA1104W電子分析天平(上海民橋精密儀器有限公司);砂仁藥材購(gòu)自瀘州市荷花中藥有限公司(批號(hào)070801,采自云南省西雙版納州),經(jīng)課題組鑒定為陽春砂;β-環(huán)糊精(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司,批號(hào)20040308,純度大于99%);乙酸乙酯(分析純)、乙酸龍腦酯化學(xué)對(duì)照品(759-200102中國(guó)藥品生物制品檢定所)。2方法和結(jié)果2.1fid分離器色譜柱硅烷化102白色載體(60~80目)、固定液5%SE-30(3mm×2m,不銹鋼柱);柱溫程序升溫80℃~140℃(15℃·min-1),140℃~200℃(40℃·min-1);載氣N2;流速30m·min-1;H2流速20mL·min-1;空氣流速200mL·min-1;初始、升溫、終止時(shí)間均為5min;FID檢測(cè)器。按此色譜條件,供試品與乙酸龍腦酯對(duì)照品峰保留時(shí)間一致(見圖1),溶劑空白乙酸乙酯在該保留時(shí)間無吸收峰,符合測(cè)定要求。2.2天麻揮發(fā)油--環(huán)糊精包合物的制備以砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物主要有效成分-乙酸龍腦酯-β-環(huán)糊精包合率為主要工藝優(yōu)選指標(biāo),以砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物收得率為輔助工藝優(yōu)選指標(biāo)的思路和方法,綜合考察砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物最佳包合工藝為:每1mL揮發(fā)油用β-環(huán)糊精8g,β-環(huán)糊精:水為1∶15,包合溫度60℃,攪拌3h(另文報(bào)道)。按此優(yōu)選工藝制備3批砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物,40℃干燥至恒重后,收集所得粉末狀白色包合物并精密稱定,置500mL圓底燒瓶中,加入蒸餾水250mL,按揮發(fā)油測(cè)定法(《中國(guó)藥典》(2005年版一部附錄XD甲法)測(cè)定,至油量不再增加時(shí)停止加熱。收集揮發(fā)油,乙酸乙酯定容于10mL量瓶中,搖勻,用定量濾紙過濾后直接進(jìn)樣,每次進(jìn)樣1μL測(cè)定。2.3對(duì)照品溶液的配制精密稱取乙酸龍腦酯化學(xué)對(duì)照品0.1927g,用乙酸乙酯溶解定容于10mL量瓶中,配制成濃度為19.27g·L-1的對(duì)照品溶液。以乙酸龍腦酯進(jìn)樣量M為橫坐標(biāo),以峰面積A為縱坐標(biāo),線性回歸方程A=6070.1572+51976.5654M,r=0.9990(n=11),在0.03854~19.27μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。2.4儀器精密度試驗(yàn)乙酸龍腦酯對(duì)照品溶液,每隔36min進(jìn)樣1次,每次0.5μL,連續(xù)進(jìn)樣12次,精密度試驗(yàn)RSD2.06%,表明儀器精密度良好;穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD2.71%,表明乙酸龍腦酯在6h內(nèi)測(cè)定含量穩(wěn)定。2.5加標(biāo)回收率試驗(yàn)取已測(cè)定含量的供試品6份,加入乙酸龍腦酯對(duì)照品適量,同法制備供試品溶液,定量測(cè)定并計(jì)算回收率,平均回收率99.4%,RSD0.988%。采用水蒸氣蒸餾法提取砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物中的乙酸龍腦酯,經(jīng)測(cè)定,乙酸龍腦酯平均空白回收率為97.7%。2.6揮發(fā)油--cd包合物收得率計(jì)算揮發(fā)油-β-CD包合物收得率=包合物質(zhì)量(g)/[揮發(fā)油投入量(g)+β-CD量(g)]×100%加權(quán)評(píng)分/綜合評(píng)分公式=30×揮發(fā)油-β-CD包合物收得率/86.36+70×乙酸龍腦酯-β-CD包合率/20.722.7表1顯示了包結(jié)物測(cè)定的結(jié)果2.8干預(yù)物質(zhì)質(zhì)量分析：ch-環(huán)糊精包合物質(zhì)量試驗(yàn)2.8.1揮發(fā)油的測(cè)定方法1號(hào)供試液:精密量取砂仁揮發(fā)油1mL,用乙酸乙酯定容于100mL量瓶中,搖勻,過濾備用;2號(hào)供試液:取β-環(huán)糊精包合物樣品溶液[精密稱取所得乙酸龍腦酯-β-CD粉末狀白色包合物約50g,置500mL圓底燒瓶中,加入蒸餾水250mL,按揮發(fā)油測(cè)定法(《中國(guó)藥典》一部附錄XD甲法)測(cè)定,至油量不再增加時(shí)停止加熱。收集揮發(fā)油,用乙酸乙酯定容于10mL量瓶中,搖勻,過濾即得]1mL,用乙酸乙酯定容于10mL量瓶中,搖勻,過濾備用;3號(hào)供試液:取砂仁包合物的無水乙醇末次洗脫液于蒸發(fā)皿中,40℃恒溫水浴上揮干乙醇,加乙酸乙酯溶解并定容于10mL量瓶中,搖勻,過濾備用;4號(hào)供試液:精密稱取8g環(huán)糊精,置500mL燒瓶中,加乙酸乙酯回流1h,濾液定容于10mL量瓶中,搖勻,過濾備用。2.8.2包合物的紫外吸收檢測(cè)取上述樣品溶液分別進(jìn)行紫外掃描檢測(cè),1,2號(hào)樣品溶液有紫外吸收,4號(hào)無相應(yīng)吸收。說明包合物已形成。3號(hào)吸收?qǐng)D譜有較弱吸收,說明包合物經(jīng)洗滌已基本洗去殘存β-CD表面的揮發(fā)油。見圖2。2.8.3揮發(fā)油的測(cè)定方法通過比較成分與包合物的氣相色譜圖,從吸收峰的位置和數(shù)目來判斷包合前后主成分的變化情況。分別精密吸取乙酸龍腦酯對(duì)照品溶液1μL、水蒸汽蒸餾法供試品溶液(精密量取砂仁揮發(fā)油1mL,用乙酸乙酯定容于100mL量瓶中,搖勻,過濾即得)1μL、乙酸龍腦酯-β-CD1μL供試品溶液(精密稱取所得乙酸龍腦酯-β-CD粉末狀白色包合物約50g,置500mL圓底燒瓶中,加入蒸餾水250mL,按揮發(fā)油測(cè)定法(《中國(guó)藥典》一部附錄XD甲法)測(cè)定,至油量不再增加時(shí)停止加熱。收集揮發(fā)油,用乙酸乙酯定容于10mL量瓶中,搖勻,過濾即得)注入GC,照2.1項(xiàng)乙酸龍腦酯GC色譜條件下測(cè)定,所得色譜圖顯示:2個(gè)樣品中乙酸龍腦酯色譜峰與乙酸龍腦酯對(duì)照品色譜峰基本一致,且包合前后揮發(fā)油中的各主要成分也基本一致。3在提取工藝和質(zhì)量控制的同時(shí)測(cè)定砂料包合物中的添加量上述研究成果基本都是圍繞砂仁揮發(fā)油-β-環(huán)糊精包合物主要有效成分乙酸龍腦酯為中心展開的。由于中醫(yī)藥發(fā)揮的是整體效應(yīng),多成分性、多靶向性、多效應(yīng)性是其基本特點(diǎn)。研究表明,砂仁中富含揮發(fā)油,是其主要的活性部位,揮發(fā)油中主含乙酸龍腦酯,次之為樟腦。研究發(fā)現(xiàn),砂仁行氣止痛、溫脾止瀉、安胎的有效部位為揮發(fā)油,與乙酸龍腦酯密不可分。砂仁化濕健脾的有效部位為水煎液中的槲皮苷、異槲皮苷。因此在后續(xù)研究項(xiàng)目中,還應(yīng)在提取工藝、砂仁有效成分-β-環(huán)糊精包合物制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中盡可能多地將砂仁水煎液中的槲皮苷、異槲皮苷提取分離出來,同時(shí)以槲皮苷、異槲皮苷為指標(biāo)優(yōu)選砂仁水提取工藝,同時(shí)以槲皮苷、異槲皮苷為指標(biāo)優(yōu)選砂仁有效成分-β-環(huán)糊精包合物制備工藝,建立HPLC同時(shí)測(cè)定砂仁有效成分-β-環(huán)糊精包合物中槲皮苷、異槲皮苷含量的方法。以期獲得更成熟的提取工藝、更合理砂仁有效成分-β-環(huán)糊精包合物制備工藝和實(shí)現(xiàn)砂仁有效成分-β-環(huán)糊精包合物更全面的質(zhì)量控制。β-環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定