鴨兒湖污染區(qū)搖蚊復(fù)合組的淀粉凝膠電泳研究

鴨兒湖污染區(qū)搖蚊復(fù)合組的淀粉凝膠電泳研究

20世紀(jì)60年代，中國廣泛使用了6000多種價光劑，如六六份。據(jù)報道,這些滯留性有機(jī)氯污染物能激活生物體內(nèi)的解毒酶系,使多功能氧化酶系(MFO),谷光甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSH)及羧酸酯酶(Carboxylesterase)活力升高,而產(chǎn)生抗性。由高活性的酯酶引起的抗性已經(jīng)在30多種衛(wèi)生害蟲和農(nóng)、牧業(yè)害蟲中研究發(fā)現(xiàn),它是引起蚊蟲對有機(jī)磷殺蟲劑產(chǎn)生抗性的主要機(jī)制。在大多數(shù)生物中,酯酶的多態(tài)性都很高,庫蚊的酯酶是迄今為止已知的多態(tài)性最高的蛋白之一,同時現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)酯酶多態(tài)性的現(xiàn)象普遍存在于敏感蚊蟲種群中。本研究選擇對鴨兒湖有毒污染物表現(xiàn)出極高的耐受性的搖蚊復(fù)合組幼蟲,試圖研究其體內(nèi)是否存在與抗生有關(guān)的酯酶(解毒酶),并從群體遺傳學(xué)的角度分析搖蚊復(fù)合組酯酶等位點的多態(tài)性。1材料和方法1.1樣品的采集點搖蚊復(fù)合組(Chironomuscomplex)幼蟲,采自武漢鴨兒湖中嚴(yán)家湖的五個氧化塘的污泥里,選擇三齡—四齡幼蟲共143只(1號塘3只,2號塘77只,3號塘15只,4號塘45只,5號塘3只),-20℃保存待用,樣品采集點如圖1所示。1.2致卷庫蚊seqTem-R系:致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus),酯酶β11的標(biāo)準(zhǔn)品系。1994年采自美國加州野生品系繁衍而來,近來已被證明為酯酶β11過量產(chǎn)生的純合型品系Selax系:致卷庫蚊,酯酶α2/β2的標(biāo)準(zhǔn)品系,來源于美國加州野外有機(jī)磷抗性致倦庫蚊種群。以上所有的標(biāo)準(zhǔn)系均系法國科學(xué)院科學(xué)與進(jìn)化研究所Raymond惠贈,液氮速凍后,在-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3-甲基-d,fluka,fluka公司水解淀粉(Starchhydrolyzed),法國科學(xué)院科學(xué)與進(jìn)化研究所產(chǎn)品,蘋果酸(Malicacid),德國Merck公司產(chǎn)品,固藍(lán)RR鹽(FastblueRRsalt),Fluka公司,輔酶Ⅰ(NAD)、輔酶Ⅱ(NADP)、吩嗪甲硫酸(Phenazinemethosulfate,PMS)、氮藍(lán)四唑(Tetrazoliumnitroblue,NBT)、噻唑藍(lán)(Tetrazoliumsalt,MTT)、磷酸甘油(α-D,L-Glycerophosphate)、瓊脂糖(Ⅱ型)均為Sigma公司產(chǎn)品,Tris,加拿大Sangon有限責(zé)任公司產(chǎn)品。1.4苯磺酸鹽系對蚊媒的抑制作用參照Pasteur等方法,采用Tris-Maleate-EDTA(TME)緩沖液系統(tǒng),測定單個搖蚊的酯酶活性。單個搖蚊勻漿后,用WhatmanNo.3制成的沁子沾濕沁子。上樣時沁子的下端要接觸膠模盤,沁子之間約2—3mm,每塊膠要有已知酯酶的蚊蟲沁子作為對照。在TME7.4緩沖液系統(tǒng)下進(jìn)行水平切片淀粉凝膠電泳,淀粉膠濃度為13.6%,在穩(wěn)壓110V,4℃恒溫下電泳。電泳完畢后,將厚膠切成數(shù)個薄片,移入染色盒進(jìn)行染色。1.5檢測凝膠的制備蘋果酸脫氫酶(MDHE.C.1.1.1.37),染色前將Tris-A緩沖液(Tris/HCl0.2mol/L-pH8.0),蘋果酸(2mol/L,pH7.0)各2mL,MgCl2(0.5mol/L)0.3mL,NAD2mL混合放在三角瓶中備用。在放有凝膠切片的染色盒中,將備用的混合液再加入NBT1mL,PMS0.3mL,MTT0.5mL混合后,與10mL加熱的1.5%瓊脂糖混合后快速均勻的鋪蓋在凝膠切片上,放在暗處直到譜帶出現(xiàn)。蘋果酸酶(MEE.C.1.1.1.40),染色前將Tris-A(Tris/HCl0.2mol/L-pH8.0)10mL,MgCl2(0.5mol/L)1.5mL,蘋果酸(2mol/L)1mL,NADP0.1mL混合放在三角瓶中備用。在放有凝膠切片的染色盒中,將備用的混合液再加入PMS0.1mL,NBT0.2mL,MTT0.2mL混合后,再與10mL加熱的1.5%的瓊脂糖混合后快速均勻的鋪蓋在凝膠切片上,放在暗處直到譜帶出現(xiàn)。1.6固藍(lán)rr-固藍(lán)鹽的制備酯酶(ESTE.C.3.1.1.1),在放有凝膠切片的染色盒中加入40mL磷酸-F緩沖液(KH2PO4,0.067mol/L;NaH2PO4,0.034mol/L),2mLα-乙酸萘酯(2%丙酮溶液)和2mLβ-乙酸萘酯(2%丙酮溶液),溫育6min后加入固藍(lán)RR鹽100mg繼續(xù)溫育,直到譜帶出現(xiàn)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPDE.C.1.1.1.8),在放有凝膠切片的染色盒中加入Tris-A緩沖液40mL,NAD1mL,a-D,L,磷酸甘油100mg,染色前加NBT1mL,PMS0.5mL,放在暗處直到譜帶出現(xiàn)。凝膠切片出帶清晰后固定風(fēng)干,記錄結(jié)果。NBT,PMS,MTT,NAD,NADP均為1%水溶液。1.7群體遺傳檢測酶位點的確定是等位酶分析中關(guān)鍵的一步。在淀粉電泳中,當(dāng)?shù)攘康摩?乙酸萘酯和β-乙酸萘酯存在時,酯酶α優(yōu)先水解α-乙酸萘酯顯紫色,酯酶β優(yōu)先水解β-乙酸萘酯顯藍(lán)色。而對每個位點的不同等位基因,則按從陰極到陽極的次序依次用1,2……表示。為了使不同膠上的同一位點的等位基因具有可比性,在每塊膠上都用已知酯酶基因的標(biāo)準(zhǔn)系作標(biāo)記,并以它為標(biāo)準(zhǔn)算出待測樣品等位基因的遷移率。再用GENEPOP軟件(3.1版)進(jìn)行有關(guān)的群體遺傳學(xué)的檢驗和計算。對少于或等于4個等位基因的位點,哈迪-溫伯格平衡的檢驗是根據(jù)Haldane的正合檢驗法進(jìn)行的,檢驗的概率值(P)是根據(jù)Louis和Dempster提出的枚舉法計算的;對4個以上的等位基因的情況,用Guo和Thompson的馬可夫鏈法(Markovchainmethod)計算P值的無偏估計值。Fis值的計算是根據(jù)Weir和Cockerham的方法進(jìn)行的。雜合子過量和不足的檢驗通過正合檢驗法進(jìn)行。每個位點上種群間的遺傳差異用Fisher的基于列聯(lián)表(R×CContinegencytable)的正合檢驗法進(jìn)行。所有位點的綜合檢驗是Fisher的方法進(jìn)行的,Fst則根據(jù)Weir和Cockerham的方法計算。有效遷移個體數(shù)(Nm)則根據(jù)公式Nm=(1/Fst-1)/4,用每個位點上的F-統(tǒng)計量(Fst)計算的。2結(jié)果2.1鴨兒湖搖蚊復(fù)組優(yōu)良植株酯酶系統(tǒng)分析以Tem-R系作為酯酶β11的標(biāo)準(zhǔn),Selax系作為酯酶α2/β2的標(biāo)準(zhǔn),用淀粉凝膠電泳方法測得鴨兒湖搖蚊復(fù)組五個亞種群單個幼蟲的酯酶類型(圖2)。酯酶染色結(jié)果表明:五個氧化塘中的搖蚊復(fù)合組幼蟲都存在高活性的β酯酶,其中1號氧化塘與其他四個氧化塘搖蚊復(fù)合組幼蟲的β酯酶不同,5號氧化塘的酯酶條帶明顯弱,這與1—5號塘的污染指數(shù)成正相關(guān)。2.2兩組標(biāo)準(zhǔn)系的比較鴨兒湖污染區(qū)搖蚊五個亞種群GPD染色結(jié)果與已報道過的其他蚊蟲GPD染色結(jié)果完全不同:酯酶基因擴(kuò)增的蚊蟲GPD一般僅有一個基因位點,其電泳遷移率,如圖3中所示的二個標(biāo)準(zhǔn)系的結(jié)果。在污染最重的1號塘GPD沒有表達(dá),5號塘的GPD表達(dá)也較弱,2、3號塘GPD位點較為豐富(圖3,2#,3#),2號塘中有的個體出現(xiàn)三個GPD位點,三個中度污染的塘GPD的位點呈多態(tài)現(xiàn)象。2.3基因型的檢測采用GENEPOP軟件(3.1版)共分析了143只搖蚊復(fù)合組幼蟲在7個基因位點(Est-1、Est-2、Gpd-1、Gpd-2、Mdh-1、Mdh-2、Me)上的基因型。其中主要分析了2號、3號、4號塘的搖蚊復(fù)組幼蟲。2.3.1哈迪-溫伯格平衡種群是否符合哈迪-溫伯格平衡是種群遺傳結(jié)構(gòu)分析的第一步,外界選擇壓力、不同種群的混合或者非隨機(jī)交配等因素都可能導(dǎo)致種群偏離哈迪-溫伯格平衡。檢驗表明:所有偏離哈迪-溫伯格平衡的情形都是由亞種群內(nèi)的雜合子不足造成的,(表1)。以2號塘為例,用Levene校正的方法計算雜合子或純合子的期望值也得到了同樣的結(jié)論,(表2)。2.3.2t值的測定種群間的遺傳差異的檢驗常用F統(tǒng)計中的一個統(tǒng)計量Fst值來衡量。本實驗檢測結(jié)果,Fst值在0.0334—0.1026之間遺傳差異不顯著,由此可見,2#、3#、4#塘搖蚊復(fù)合組亞種群間基本沒有分化(表3)。2.3.3每一代的棲息地移民數(shù)nm檢測的三個塘中有效遷移個體數(shù)都比較少,表明這三個塘間的基因流動較少(表4)。3搖蚊復(fù)合組的污染狀況運(yùn)用淀粉凝膠電泳對采自鴨兒湖污染區(qū)的搖蚊復(fù)合組種群進(jìn)行研究后,發(fā)現(xiàn)存在高活性的酯酶,但其電泳遷移率與致倦庫蚊Tem-R及Selax標(biāo)準(zhǔn)系蚊蟲遷移率不同,取樣種群中存在兩種β酯酶基因。鴨兒湖尤其嚴(yán)家湖1號塘內(nèi)有機(jī)氯污染物長期污染作用的結(jié)果,使得搖蚊復(fù)合組體內(nèi)產(chǎn)生一種與庫蚊個體內(nèi)檢測不同的高活性β酯酶。有關(guān)鴨兒湖污染區(qū)搖蚊復(fù)合組酯酶的特征有待進(jìn)一步分析,如能將此特殊環(huán)境下選擇出的高活性酯酶克隆,再用于對這些特殊污染物的降解中,則有重大的應(yīng)用價值。搖蚊復(fù)合組幼蟲在厭氧污泥中生存的特點,通常被用作污染程度現(xiàn)場監(jiān)測的指示。在嚴(yán)家湖這四個污染最嚴(yán)重的塘中采得搖蚊復(fù)合組個體中,所檢測的七個位點上的基因大多處于純合狀態(tài),由于雜合子不足造成偏離哈迪-溫伯格平衡,在鴨兒湖污染區(qū)中亞種群間的遺傳差異不顯著,基因交流也比較少。雜合子的比率是遺傳多樣性的標(biāo)志,雜合子的比率高是遺傳多樣性高的標(biāo)志,因為每一雜合子攜帶不同的等位基因,代