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甲醛滴定法測(cè)定氨基酸含量(一)測(cè)定方法概述
1、測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法:凱氏定氮法快速測(cè)定法(雙縮脲、紫外、水楊酸比色、染料結(jié)合法)2、測(cè)定氨基酸的方法:甲醛、電位滴定、茚三酮比色氣相、液相、薄層、離子交換色譜自動(dòng)分析儀(二)凱氏定氮法
1、實(shí)驗(yàn)原理以硫酸銅為催化劑,用濃硫酸消化試樣,使有機(jī)氮分解為氨,與硫酸生成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨逸出,用硼酸溶液吸收,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的消耗量計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。2、實(shí)驗(yàn)步驟(1)試樣的制備與稱樣(稱0.5-5g試樣(含氮30-40mg)放入凱氏燒瓶中)。(2)消化
向凱氏燒瓶中依次加入硫酸銅0.4g、硫酸鉀10g、硫酸20mL。將凱氏燒瓶放在電爐上,緩慢加熱。待起泡停止,內(nèi)容物均勻后,升高溫度,保持液面微沸。當(dāng)溶液呈藍(lán)綠色透明時(shí),繼續(xù)加熱0.5-1h。取下凱氏燒瓶冷卻至約40℃,緩慢加人適量水,搖勻,冷卻至室溫。
(3)蒸餾與吸收
將消化好并冷卻至室溫的消化溶液全部轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中,用蒸餾水定容至刻度,搖勻。
向接收瓶?jī)?nèi)加入30mL2%硼酸溶液和1滴混合指示劑。將接收瓶置于蒸餾裝置的冷凝管下口,使下口浸入硼酸溶液中。取10±0.05mL稀釋定容后的試液,沿小玻璃杯移入反應(yīng)室。并用少量水沖洗小玻璃杯,一并移入反應(yīng)室。塞緊棒狀玻璃塞,向小玻璃杯內(nèi)加入約10mL40%氫氧化鈉溶液。提起玻璃塞,使氫氧化鈉溶液緩慢流入反應(yīng)室。立即塞緊玻璃塞,并在小玻璃杯中加水,使之密封。通入蒸汽,蒸餾5min。降低接收瓶的位置,使冷凝管管口離開液面,繼續(xù)蒸餾1min。用少量蒸餾水沖洗冷凝管管口,洗液并入接收瓶?jī)?nèi)。取下接收瓶。(4)滴定
用0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定收集液至剛剛出現(xiàn)紫紅色為終點(diǎn)。
同一試樣做兩次平行實(shí)驗(yàn),同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。3、結(jié)果計(jì)算
(V0/V)×0.014×cX(%)=----------------------------×F×100
m×(10/100)(三)快速測(cè)定法
為滿足生產(chǎn)過程的快速控制分析,減少環(huán)境污染、簡(jiǎn)便操作省時(shí),建立了快速測(cè)定方法;如:雙縮脲法、紫外分光光度法、水楊酸比色法、染料結(jié)合法。1、雙縮脲法(1)原理:雙縮脲在堿性條件下,能與硫酸銅結(jié)合生成紅紫色絡(luò)合物。蛋白質(zhì)中含有肽鍵,與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似,也呈此反應(yīng)。在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比;λmax=560nm可用吸收光度法進(jìn)行比色測(cè)定。(2)測(cè)定①標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
以采用凱氏定氮法測(cè)出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣,按蛋白質(zhì)含量40、50、60、70、80、90、100、110mg稱取樣品8份于納氏比色管中,各加入1mlCCl4(阻滯淀粉、還原糖、色素、類脂物溶解,,消除干擾)加入雙縮脲試劑(酒石酸鉀鈉,KOH,CuSO4)50.00ml振搖均勻(10min)靜置1h,取上層清液離心5min,再測(cè)λmax=560nm時(shí)的A(水作參比)。②樣品測(cè)定
準(zhǔn)確稱取適量樣品,同樣方法測(cè)樣品的A。(3)計(jì)算
蛋白質(zhì)(%)=
(X/W)×100
x——從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得蛋白質(zhì)含量,mgw——測(cè)定樣液相當(dāng)樣品質(zhì)量,mg(4)說明①高脂肪樣品,先用醚抽出棄之。②若有不溶物可抽出蛋白質(zhì)后再測(cè)。2、水楊酸比色法(1)原理:樣品中蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化后轉(zhuǎn)變?yōu)殇@鹽,與水楊酸鈉作用生成藍(lán)色化合物,在λmax=660nm處比色測(cè)定,求出含氮量,計(jì)算蛋白質(zhì)%。(2)測(cè)定:①標(biāo)準(zhǔn)曲線吸取含氮2.5μg/ml的硫酸銨(NH4)2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置于25ml容量瓶中,分別加入:空白酸溶液2ml、磷酸鹽緩沖液5ml、加水至15ml、水楊酸鈉5ml、36~37℃恒溫水浴15min,加入次氯酸鈉2.5ml,再在36~37℃恒溫15min,加水至刻度,λmax=660nm測(cè)A。
②樣品處理:稱取0.2~1.0g置于凱氏燒瓶中,加入15ml濃H2SO4,0.5gCuSO4,4.5g無水硫酸鈉,小火加熱沸騰后,進(jìn)行消化,待溶液澄清,呈暗綠色時(shí),冷卻,移至250ml容量瓶中,定容。③樣品測(cè)定:吸取樣液5ml(必要時(shí)稀釋)以下步驟同上“標(biāo)準(zhǔn)曲線”操作。(3)計(jì)算
蛋(%)=總氮(%)×F(6.25)
X--含氮量μg,k--樣品稀釋倍數(shù),m--樣品質(zhì)量,g。(4)說明:①消化樣品,當(dāng)天測(cè)定,重現(xiàn)性好。②嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度(36~37℃),因?yàn)橛绊戯@色。(四)氨基酸總量測(cè)定1、雙指示劑甲醛滴定法(測(cè)定游離氨基酸)有單指示劑滴定法、雙指示劑滴定法。單指示劑有:百里酚酞,酚酞。雙指示劑有:中性紅—百里酚酞。其原理均是用甲醛與NH2作用,使堿性消失,再用強(qiáng)堿滴定COOH。測(cè)定:①樣品(溶液)(20—30mg氨基酸+H2O+3滴中性紅,用0.1NNaOH滴定至黃橙色(V1)②樣品+中性甲醛+3滴百里酚酞,搖,靜1min,用0.1NNaOH滴定至淡藍(lán)色(V2)。計(jì)算:
氨基酸態(tài)氮(%)=
[(V2-V1)×C×0.014]/W*100式中:V1——用中性紅作指示劑滴定時(shí)消耗氫氧化鈉的體積,V2——用百里酚酞作指示劑滴定時(shí)耗氫氧化鈉的體積。2、電位滴定法(1)原理:加入甲醛,固定氨基堿性。用酸度計(jì)指示滴定終點(diǎn),據(jù)加入甲醛后耗用NaOH量計(jì)算蛋白質(zhì)%。適用于混濁及色深樣品的直接滴定。(2)測(cè)定:①樣液用NaOH滴定至pH=7.5~8.2。②加入中性20%甲醛后,用NaOH滴至pH=9.2。③同時(shí)作空白試驗(yàn)。(3)計(jì)算:3、茚三酮比色法(1)原理氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合物,λmax=570nm其顏色深淺與氨基酸含量成正比。(2)測(cè)定①準(zhǔn)確吸取100μg/ml氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml至比色管中,補(bǔ)加水至相同體積。加入茚三酮、磷酸緩沖液各1ml,水浴中加熱15min。加水至(或轉(zhuǎn)入容量瓶中)25ml,靜置15min。在570nm下以空白液為參比液,測(cè)A,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②樣品測(cè)定吸取樣液1~5ml,用同樣條件下測(cè)A,查出氨基酸μg。(3)計(jì)算
X氨基酸總量(mg%)=---------------×100
m×1000(五)個(gè)別氨基酸的測(cè)定
例:游離賴氨酸的測(cè)定①原理賴氨酸與茚三酮在pH<3的專一顯色反應(yīng),在λ=475nm處測(cè)A,分析范圍=0.075~0.2mg/ml。②測(cè)定a標(biāo)準(zhǔn)曲線
在試管中分別加入賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2mg/ml)0.75、1.0、1.25、1.
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