森林洞巢鳥類雜色山雀的生態(tài)學(xué)特性

森林洞巢鳥類雜色山雀的生態(tài)學(xué)特性

不同顏色的山雀屬于門靜脈和科。這是分布范圍有限的小型森林洞鳥，具有東亞獨(dú)特的鳥類。種群數(shù)量稀少,不常見,已列入《亞洲鳥類紅皮書》和《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書》,受脅等級(jí)為易危,并且列入遼寧省重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物名錄。主要分布在中國(guó)、日本和朝鮮半島,現(xiàn)全球只有8個(gè)亞種。我國(guó)僅有2個(gè)亞種,分別是指名亞種P.v.varius和臺(tái)灣亞種P.v.castaneoventris。指名亞種僅繁殖于遼寧省的東部山區(qū),臺(tái)灣亞種僅分布于臺(tái)灣。雜色山雀是單態(tài)性鳥(monomorphicbirds),即雌雄同型。雌雄成鳥在形態(tài)上沒有大的區(qū)別,所以僅從外部形態(tài)辨別雜色山雀的雌雄非常困難,而雛鳥由于其性別指示的羽色特征還未出現(xiàn),所以對(duì)雛鳥進(jìn)行安全而準(zhǔn)確的性別鑒定就更加困難。性別鑒定的困難不僅影響到雜色山雀的種群生態(tài)、引種繁殖、性別比率、群體遺傳分析等方面的研究,而且限制了雜色山雀研究工作的進(jìn)一步深入,所以雜色山雀性別鑒定技術(shù)的研究和建立迫在眉睫。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)單態(tài)性鳥類的性別鑒定主要采用形態(tài)學(xué)方法如行為判定法、翻肛法、外科手術(shù)判定法等,這些方法或費(fèi)時(shí)、或費(fèi)力、或?qū)B類有較大的傷害性,而且精確度也不高,對(duì)于珍稀鳥類來說尤為不適合。20世紀(jì)以來,鳥類性別鑒定方法隨著性別決定機(jī)制研究的深入也得到了同步發(fā)展,從個(gè)體水平、細(xì)胞水平發(fā)展到分子水平。用分子生物學(xué)方法進(jìn)行性別鑒定是近10年來發(fā)展起來的一種利用性染色體連鎖基因探針和PCR擴(kuò)增技術(shù)的新方法,在很多鳥類研究中已得到成功的應(yīng)用。針對(duì)性染色體特異基因—CHD基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法是迄今發(fā)現(xiàn)適用范圍最廣、最為簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確可靠、常見的鳥類性別分子鑒定方法[10,11,12,13,14,15,16,17]。但在CHD基因性別鑒定特異性引物的選擇上,引物P2/P8是目前進(jìn)行非平胸鳥類性別鑒定運(yùn)用最普遍的引物;引物2550F/2718R以其諸多優(yōu)點(diǎn)正在被推廣應(yīng)用。但究竟哪對(duì)引物適于雜色山雀的性別鑒定,還未見報(bào)道。本研究的目的就是期望為雜色山雀尋找到一種快捷方便、采樣量少、鑒定精度高的性別鑒定的分子方法,并摸索該引物的最佳PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系,為未來進(jìn)行雜色山雀種群性別狀況的研究提供基本技術(shù)方法。1材料和方法1.1雜色山雀取樣取自遼寧省白石砬子自然保護(hù)區(qū)24只雜色山雀,其中5只已知性別的雜色山雀,是通過繁殖期的坐巢行為判定性別,其余19只未知性別的雜色山雀是4只已知性別雜色山雀子代雛鳥。本研究為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)樣本,取樣方式采用非傷害性取樣,拔取雜色山雀腹部羽毛或從腋下取微量血液。5只已知性別的雜色山雀編號(hào)為:07-51M(♀)、07-81M(♀)、07-57F(♂)、07-199F(♂)、06-XF(♂);19只待測(cè)性別的雛鳥編號(hào)為:07-51-1、07-51-2、07-51-3、07-51-4、07-51-5、07-51-6、07-57-1、07-57-2、07-57-3、07-57-4、07-81-1、07-81-2、07-81-3、07-81-4、07-199-1、07-199-2、07-199-3、07-199-4、07-199-5。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1dna模板的提取(1)取2根腹羽的羽髓用傳統(tǒng)的酚氯仿方法提取DNA模板。(2)取2根腹羽的羽髓或剪取5mm×5mm大小的血濾紙,以Chelex-100為介質(zhì)快速提取DNA模板。用Cary紫外可見光分光光度儀測(cè)量DNA模板的濃度。將模板用TE溶液稀釋,使其濃度為10pmol/μl,置于4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2r的合成引物P2/P8和引物2550F/2718R由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,用TE溶液重建并稀釋,使其濃度為10pmol/μl。引物的序列為:1.2.3凝膠成像實(shí)驗(yàn)取3μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物,在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳30min,用Dolphin-Doc凝膠成像系統(tǒng)(WEALTEC公司)進(jìn)行拍照,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。電泳結(jié)果中,單條帶表示此個(gè)體性別為雄性,雙條帶表示此個(gè)體性別為雌性。2結(jié)果2.1w、w染色體利用5只已知性別的雜色山雀?jìng)€(gè)體對(duì)引物P2/P8和引物2550F/2718R的有效性進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、2所示。從圖1可以看出,引物P2/P8擴(kuò)增產(chǎn)物電泳清晰地顯示:雌性為兩個(gè)條帶,雄性為一個(gè)條帶,性別鑒定結(jié)果與已知性別相符,準(zhǔn)確率達(dá)到100%。引物P2/P8在W染色體上擴(kuò)增片段大于Z染色體上擴(kuò)增片段,Z、W染色體上擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大約在350bp~400bp,兩片段長(zhǎng)度差異顯著。從圖2中可以看出,檢測(cè)雌性樣本時(shí)顯示兩個(gè)條帶,與實(shí)際性別相符;但檢測(cè)雄性樣本時(shí),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定,即使同一樣本,重復(fù)實(shí)驗(yàn),電泳圖片有時(shí)顯示兩個(gè)條帶,有時(shí)顯示一個(gè)條帶,無法準(zhǔn)確有效地對(duì)雜色山雀進(jìn)行性別鑒定。表1為兩對(duì)引物對(duì)已知性別樣本鑒定結(jié)果。引物2550F/2718R在W染色體上擴(kuò)增片段小于Z染色體上擴(kuò)增片段,Z、W染色體上擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大約在550bp~650bp,兩片段長(zhǎng)度差異顯著。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:對(duì)雜色山雀,引物P2/P8可以準(zhǔn)確地進(jìn)行性別鑒定,而引物2550F/2718R不能準(zhǔn)確地進(jìn)行性別鑒定。2.2酚/氯-1、酚/hpv-100和chelex-100為介質(zhì)快速提取dna經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)效果對(duì)比,剪取羽毛中的羽髓,用酚/氯仿提取DNA方法和以Chelex-100為介質(zhì)快速提取DNA的方法,實(shí)驗(yàn)效果一樣。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。2.31pcr反應(yīng)條件及模板用量的確定利用篩選出的有效引物P2/P8對(duì)5只已知性別的雜色山雀的個(gè)體進(jìn)行鑒定,確定PCR反應(yīng)條件以及模板的用量(詳見實(shí)驗(yàn)方法1.2.2)。然后對(duì)19只雜色山雀雛鳥進(jìn)行性別鑒定,鑒定結(jié)果見表2。圖4為利用引物P2/P8對(duì)未知雜色山雀雌雄個(gè)體進(jìn)行性別鑒定檢測(cè)結(jié)果部分電泳圖片。3討論3.1pcr擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果特異性引物P2/P8和2550F/2718R盡管擴(kuò)增CHD基因不同的片段,但性別鑒定的原理相同。其原理為:鳥類性別決定方式為ZW型,即雌性為ZW型,雄性為ZZ型。直接通過特異性引物對(duì)Z和W兩個(gè)染色體上同源的特異序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)在CHD-W和CHD-Z基因中內(nèi)含子大小的差異,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)為:雌性為兩條帶;雄性為一條帶。本實(shí)驗(yàn)用5只已知性別的雜色山雀對(duì)引物P2/P8和引物2550F/2718R的有效性進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)特異性引物P2/P8可以準(zhǔn)確快速地鑒定雜色山雀的性別,準(zhǔn)確率達(dá)到100%,從圖1可以發(fā)現(xiàn)雖然擴(kuò)增的CHD-W片段比CHD-Z片段長(zhǎng),但是CHD-W條帶與CHD-Z條帶距離較大,2.5%的瓊脂糖凝膠電泳很容易區(qū)分,并沒有出現(xiàn)在一些物種中應(yīng)用引物P2/P8擴(kuò)增CHD-Z基因和CHD-W基因的產(chǎn)物大小十分相似,瓊脂糖凝膠電泳很難區(qū)分和CHD-Z基因自身出現(xiàn)多態(tài)性,導(dǎo)致對(duì)CHD-Z基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)2個(gè)或多個(gè)等位基因,造成性別難以鑒定等問題。進(jìn)一步驗(yàn)證了此對(duì)引物適用于雜色山雀的性別鑒定。而正在逐漸推廣的特異性引物2550F/2718R在本研究中卻出現(xiàn)了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不穩(wěn)定造成性別誤判的問題。其原因還有待于進(jìn)一步研究。3.2chelex-100的應(yīng)用在動(dòng)物的分子生物學(xué)研究中,傳統(tǒng)的酚/氯仿方法由于提取DNA的純度高,其應(yīng)用較為廣泛。但此方法需經(jīng)過蛋白酶K的消化,酚氯仿的抽提,乙醇的沉淀等步驟,操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí);所用的有機(jī)溶劑對(duì)人體有害;要求樣本量大,保存要求高;同時(shí)整個(gè)過程需要在多個(gè)離心管之間轉(zhuǎn)移,增加了樣本間的交叉污染機(jī)會(huì)。Chelex-100作為一種由聚乙烯二烯苯組成的螯合劑,對(duì)多價(jià)金屬離子有螯和作用。生物樣本中的金屬離子在高溫和低離子強(qiáng)度溶液條件下能催化DNA的降解,而Chelex-100有效地防止了煮沸過程中模板DNA的降解,既可以減少DNA的損失,又可以消除PCR擴(kuò)增中的一些抑制因素(如重金屬離子),提高了PCR擴(kuò)增的效率;另外提取過程始終在同一試管中進(jìn)行,不僅減少了污染機(jī)會(huì),而且減少了DNA的損失,更適宜微量取樣樣本。雖然Chelex-100為介質(zhì)提取的DNA純度不高,但是由于PCR技術(shù)對(duì)DNA樣品的純度要求相對(duì)較低,對(duì)微量的DNA即可擴(kuò)增,僅需要待擴(kuò)增的靶序列完整即可。所以Chelex-100為介質(zhì)提取的微量DNA,即可滿足PCR擴(kuò)增的要求。本研究對(duì)同一樣本同一部位拔取的羽毛,剪取約2mm的羽毛基部,分別采用酚/氯仿的方法和Chelex-100方法提取DNA,比較PCR的實(shí)驗(yàn)效果基本相同(見圖3)。本研究還比較了Chelex-100方法從血痕、羽毛樣本中提取DNA與酚/氯仿的方法從肌肉樣本中提取DNA的結(jié)果,通過PCR擴(kuò)增,比較實(shí)驗(yàn)效果基本相同。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)樣本的不同,我們可以選擇不同的提取DNA的方法。對(duì)于微量或陳舊的DNA樣品,例如從血液、羽毛、孵化的蛋殼、唾液、尿液、糞便等樣本中提取DNA[21~23],建議采用Chelex-100法,操作簡(jiǎn)單便捷且結(jié)果可靠,只是實(shí)驗(yàn)成本稍高些;若樣品量較大,如肌肉或內(nèi)臟取樣,則建議采用成本低廉的酚/氯仿法提取DNA。3.3chd基因片段對(duì)雜色山雀的分子鑒定就種群性比而言,其意義將隨各物種的雌雄關(guān)系而不同。對(duì)于單配性(monogamy)的鳥類來說,性比1:1對(duì)于種群增長(zhǎng)最有利,偏離此比例則意味著有一部分雄性或雌性成體不能參加繁殖。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果,雜色山雀雛鳥性比(♂/♀)為1.71:1,初步得出雜色山雀性比偏離雌性,這意味著有很大一部分雄性個(gè)體由于找不到配偶而無法繁殖后代,造成雜色山雀有效種群數(shù)量銳減,這是否就是導(dǎo)致雜色山雀分布狹窄、數(shù)量稀少的原因之一,還需要更大量的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。本研究采用非傷害性取樣方法,以Chelex-100為介質(zhì)快速提取DNA模板,利用P2/P8引物擴(kuò)增CHD基因片段對(duì)雜色山雀的性別能夠快速、簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確的鑒定。PCR反應(yīng)條件:94℃/4min,(94℃/30s,50℃/45s,72℃/30s)35Cycles,72℃/7min,4℃/∞。該分子鑒定方法為日后統(tǒng)計(jì)雜色山雀的種群性比現(xiàn)狀,進(jìn)行雜色山雀的性比研究提供基本技術(shù)方法。P2:5’-TCTGCATCGCTAAATCCTTT-3’P8:5’-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3’2550F:5’-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3’2718R:5’-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3’反應(yīng)體系為