-淀粉酶熱穩(wěn)定性及失活動(dòng)力學(xué)研究

-淀粉酶熱穩(wěn)定性及失活動(dòng)力學(xué)研究

i-淀粉酶（i-1，4-葡萄糖-4-葡萄糖水解酶）是一種內(nèi)切淀粉酶。根據(jù)c-1和4-葡萄糖糖的含量，隨機(jī)解碼-1，產(chǎn)生糊精和還原糖。i-淀粉酶主要來(lái)源于枯草桿菌、地衣菌、嗜熱脂肪芽菌、米曲霉、黑曲霉、鏈霉菌、丙酮-丁醇梭菌、擬內(nèi)孢酶等微生物和動(dòng)植物組織。目前，ii-淀粉酶廣泛應(yīng)用于紡織、輕化工業(yè)、食品、造紙、醫(yī)藥、石油開(kāi)采等領(lǐng)域。α-淀粉酶作為一種生物催化劑,因高溫條件下半衰期短、易失活等缺點(diǎn)嚴(yán)重影響其使用效果.如用于織物前處理退漿只能低溫堆置,要提高退漿率唯有延長(zhǎng)處理時(shí)間.因此,提高酶的熱穩(wěn)定性,以擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域的研究已越來(lái)越引起人們的關(guān)注.目前,提高酶熱穩(wěn)定性的方法有:添加穩(wěn)定劑、化學(xué)修飾、固定化、蛋白質(zhì)工程技術(shù)等,其中在液體酶制劑中加入熱穩(wěn)定劑是一種最經(jīng)濟(jì)有效的辦法.王耀兵等人在60℃條件下加入2.5mmol/LRb+或Li+能將淀粉酶的穩(wěn)定性提高1.25~1.5倍;25~50mmol/LNa+能將穩(wěn)定性提高2.3倍;25~50mmol/LK+能將穩(wěn)定性提高1.7倍.本文研究了醋酸鈣、乳酸鈉對(duì)α-淀粉酶熱穩(wěn)定性的影響以及熱失活動(dòng)力學(xué)性質(zhì).1實(shí)驗(yàn)1.1淀粉、碘、碘化鉀材料:α-淀粉酶(科凱精細(xì)化工上海有限公司),醋酸鈣、乳酸鈉為化學(xué)純,可溶性淀粉、碘、碘化鉀為分析純.儀器:超級(jí)恒溫器(上海市試驗(yàn)儀器廠),電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠),精密增力電動(dòng)攪拌器(上海碩光電子科技有限公司),UV-VIS型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),電子天平(上海精科).1.2測(cè)試方法1.2.1酶活力測(cè)定顯色法測(cè)定酶活:取1mL酶液(5g/L)加入到1mL淀粉溶液(2g/L)中,在40℃恒溫水浴條件下反應(yīng)8min后用0.5mL鹽酸溶液(1mol/L)終止反應(yīng),再加入2mL碘-碘化鉀溶液(0.2%I2-2%KI),稀釋至50mL,以2mL碘-碘化鉀溶液和0.5mL1mol/L的鹽酸溶液為空白溶液,在570nm處測(cè)定吸光度.利用標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度換算成相應(yīng)酶活.酶活力單位(1U)定義為:40℃時(shí),1min內(nèi)1mg酶水解的淀粉量(mg).1.2.2酶活測(cè)定法取240mL蒸餾水或熱穩(wěn)定劑溶液于三頸瓶中,置于恒溫水浴中加熱,待升到所需溫度后,加入10mL酶液(5g/L),開(kāi)始計(jì)時(shí),每隔一定時(shí)間取1mL試樣用顯色法測(cè)定酶活.1.2.3失活速率及壽命測(cè)定熱穩(wěn)定劑的熱穩(wěn)定效果由指定溫度下失活速率常數(shù)(k)、半衰期(t1/2)和活化能(Ea)的變化來(lái)表征,本文指定溫度為80℃.其中失活速率常數(shù)越小,半衰期越大,活化能越大,熱穩(wěn)定劑的熱穩(wěn)定效果越好.失活速率常數(shù)(k)的測(cè)定:若為一級(jí)反應(yīng),由速率方程lnA=-kt可求得k,其中A是酶活,t是失活時(shí)間.半衰期(t1/2)的測(cè)定:指定溫度下,酶活降低一半需要的時(shí)間;活化能(Ea)的測(cè)定:lnk=lnk0-(Ea/RT),其中k是失活速率常數(shù),T是溫度.2結(jié)果與討論2.1-淀粉酶失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)由圖1可觀察到,未加熱穩(wěn)定劑的α-淀粉酶呈線性失活,lnA對(duì)失活時(shí)間t作圖是一條直線,說(shuō)明未加熱穩(wěn)定劑的酶失活符合一級(jí)反應(yīng)(R2>0.99).相關(guān)的失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表1所示.由表1可知,α-淀粉酶在50℃時(shí)半衰期為12.0min,在70℃時(shí)失活速率常數(shù)由0.0565min-1增大到1.0820min-1,半衰期僅為1.8min,80℃時(shí)半衰期為0.4min,可知溫度對(duì)此酶的半衰期影響很大.2.2不同熱劑的濃度對(duì)i-iid-淀粉酶的初始酶活性和半衰期的影響2.2.1最佳濃度的確定由圖2可知,隨著醋酸鈣濃度的提高,初始酶活和半衰期都先增后降,0.001mol/L時(shí)初始酶活最大,0.02mol/L時(shí)半衰期最大,這可能跟醋酸鈣與酶形成了某種絡(luò)合結(jié)構(gòu)有關(guān).80℃時(shí)0.01mol/L醋酸鈣將半衰期提高到89.9min,而且初始酶活也由原來(lái)的1.25提高到1.29,所以選擇0.01mol/L為最佳濃度.2.2.2乳酸鈉初始酶最佳濃度的確定由圖3可以看出,乳酸鈉濃度為0.002mol/L時(shí)初始酶活最大,而0.02mol/L時(shí)卻有最大的半衰期.80℃時(shí)0.02mol/L乳酸鈉將半衰期提高到167.1min,初始酶活由原來(lái)的1.25提高到1.48,所以選擇0.02mol/L為最佳濃度.2.3添加熱劑后的失運(yùn)動(dòng)力2.3.1加入醋酸鈣的最適條件加入0.001mol/L、0.01mol/L、0.02mol/L醋酸鈣后淀粉酶的失活動(dòng)力學(xué)如圖4所示.由圖4可看出,加入醋酸鈣后酶的失活過(guò)程與未加熱穩(wěn)定劑時(shí)不同,開(kāi)始時(shí)失活較快,原因是醋酸鈣和酶之間的絡(luò)合需要時(shí)間.隨著絡(luò)合物的形成,酶的失活過(guò)程符合一級(jí)反應(yīng)(R2>0.98),并在這段時(shí)間內(nèi)研究熱穩(wěn)定劑的效果,測(cè)定失活動(dòng)力學(xué)參數(shù).加入醋酸鈣后α-淀粉酶的失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示.由表2可看出,80℃下失活速率常數(shù)為0.0052min-1,半衰期還有89.9min,大大提高了α-淀粉酶的使用溫度范圍.由方程lnk=lnk0-(Ea/RT)可知,可利用圖5中的斜率=-Ea/R求得Ea,見(jiàn)表3.由表3可知,加入醋酸鈣后淀粉酶的熱穩(wěn)定性大大提高,活化能由139.88kJ/mol提高到179.43kJ/mol2.3.2乳酸鈉后-淀粉酶的失活動(dòng)力學(xué)加入0.01mol/L、0.02mol/L、0.06mol/L乳酸鈉后淀粉酶的失活動(dòng)力學(xué)如圖6所示.與圖4比較可知,加入乳酸鈉后酶的失活動(dòng)力學(xué)與醋酸鈣相似.加入乳酸鈉后α-淀粉酶的失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表4所示.由表3、表4可看出,加入乳酸鈉后淀粉酶的熱穩(wěn)定性得到很大提高,活化能由139.88kJ/mol提高到174.43kJ/mol;70℃下失活速率常數(shù)由1.082min-1降低到0.0008min-1,半衰期由1.8min提高到470.4min在80℃條件下半衰期還有167.1min,大大提高了淀粉酶的使用溫度范圍.3未加熱穩(wěn)定劑的淀粉酶失活動(dòng)力學(xué)(1)熱穩(wěn)定劑濃度對(duì)α-淀粉酶的影響為:隨著濃度的提高,初始酶活和半衰期都先增后降,0.001mol/L醋酸鈣和0.002mol/L乳酸鈉時(shí)初始酶活最大,0.02mol/L醋酸鈣和0.02mol/L乳酸鈉時(shí)半衰期達(dá)最大.(2)未加熱穩(wěn)定劑的淀粉酶失活動(dòng)力學(xué)符合一級(jí)反應(yīng)(R2>0.99);添加熱穩(wěn)定劑后此酶的失活動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化,但失活中后期符合一級(jí)反應(yīng)(R2>0.98),并在這段時(shí)間內(nèi)研究熱穩(wěn)定劑的效果.(3)未加熱穩(wěn)定劑的淀粉酶在50℃時(shí)失活,半衰期只有12.0min,70℃失活速率常數(shù)明顯增大,由0.0565min-1增大到1.0820