冰凍切片與石蠟切片的區(qū)別之歐陽(yáng)美創(chuàng)編

歐陽(yáng)美創(chuàng)編 歐陽(yáng)美創(chuàng)編 2021.01.01 歐陽(yáng)美創(chuàng)編 2021.01.01歐陽(yáng)美創(chuàng)編 歐陽(yáng)美創(chuàng)編 2021.01.01 歐陽(yáng)美創(chuàng)編 2021.01.011.冰凍切片是免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突出的優(yōu)點(diǎn)是能夠較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組織均可作冰凍切片。時(shí)間：2021.01.01創(chuàng)作^歐陽(yáng)美冰凍時(shí)，組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時(shí)，影響較小，冰晶小而多時(shí)，對(duì)組織結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組織中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長(zhǎng)速率成正比，而與成核率(形成速率)成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對(duì)組織結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量。Fish認(rèn)為冰凍開(kāi)始時(shí)，冰晶成核率較慢，以后逐漸增加，其臨界溫度為-33。C,從-30。C降至-43。C之間，成核率急劇增加達(dá)1018,然后再減慢?；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧p少冰晶的形成。(1)速凍，使組織溫度驟降，縮短從-33。C43OC的時(shí)間,減少冰晶的形成。其方法有二：干冰-丙酮（酒精）法:將150-200nil丙酮（酒精）裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時(shí)，溫度可達(dá)-70°CC,用一小燒杯（50-100inl）內(nèi)裝異戊烷約50ml,再將燒杯緩慢置入干冰丙酮（純酒精）飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-709時(shí)即可使用。將組織（大小為lcmXO.8cmX0.5cm）投入異戊烷內(nèi)速凍30-60s后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-8（rc低溫冰箱內(nèi)貯存。液氮法：將組織塊平放于軟塑瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）,如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v，此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織冰塊立即置入-8（TC冰箱貯存?zhèn)溆?，或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。（2）將組織置于20%-30%蔗糖溶液1?3天，利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。影響冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。目前冰凍切片機(jī)有兩類(lèi)：①恒慢冰凍切片機(jī)（Cryastat）：為較理想的冰凍切片機(jī)，型號(hào)很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于-30°CC低溫密閉室內(nèi),故切片時(shí)不受外界溫度和環(huán)境影響，可連續(xù)切薄片至2-4ym,完全能滿(mǎn)足免疫組織化學(xué)標(biāo)記要求。切片時(shí)，低溫室內(nèi)溫度以-15°C~18°C為宜，溫度過(guò)低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動(dòng)。②開(kāi)放式冰凍切片機(jī)：包括半導(dǎo)體致冷切片機(jī)和甲醇致冷切片以及老式的C02、氯乙烷等冷凍切片機(jī)。切片時(shí)暴露空氣中，溫度不易控制，切片技術(shù)難度大，在高溫季節(jié)，切片更加困難,且切片厚8?15um,不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉，國(guó)內(nèi)有生產(chǎn)。冰凍切片后如不染色，必須吹干，貯存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存。2.石蠟切片其優(yōu)點(diǎn)是組織結(jié)構(gòu)保存良好，在病理和回顧性研究中有較大的實(shí)用價(jià)值，能切連續(xù)薄片，組織結(jié)構(gòu)清晰，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組化技術(shù)的石蠟切片制備與常規(guī)制片略有不同：①脫水、透明等過(guò)程應(yīng)在4￡。C下進(jìn)行，以盡量減少組織抗原的損失。②組織塊大小應(yīng)限于2cmX1.5cmX0.2cm,使組織充分脫水、透明、浸蠟。③浸蠟、包埋過(guò)程中，石蠟應(yīng)保持在6（TC以下，以溶點(diǎn)低的軟蠟最好（即低溫石蠟包埋）。組織塊脫水、透明、浸蠟時(shí)間參考表1-3：表1-3組織塊處理時(shí)間表70%乙醇4°C3?4h80%乙醇4°C3?4h90%乙醇4°C2?3h95%乙醇I4°C2?3h95%乙醇II4°C1?2h100%乙醇I4°C1.5h100%乙醇II4°C1.5h二甲苯I4°C0.5?lh二甲苯II4°C0.51?lh石蠟I60°Clh石蠟II60°C2h以上全過(guò)程為18-24h,也可在室溫內(nèi)使用自動(dòng)脫水機(jī)代替。如組織塊小，直徑小于0.5cm,可用快速石蠟包埋切片，全過(guò)程只需4h左右。石蠟切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2?7urn,應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性，染色均勻一致。由于甲醛固定、有機(jī)熔劑和包埋劑對(duì)組抗原有一定的損害及遮蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報(bào)告經(jīng)蛋白酶消化，可以改善光鏡免疫組化染色強(qiáng)度，常用的有胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蠟切片應(yīng)入37*恒溫箱過(guò)夜，這樣烤片可減少染色中脫片現(xiàn)象。切片如需長(zhǎng)期貯存，可存放于QC冰箱內(nèi)備用。石蠟切片優(yōu)點(diǎn)較多，但在制片過(guò)程中要經(jīng)過(guò)酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑處理，組織內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干燥包埋法(Freezedryingembeddingmethed),可以保存組織內(nèi)可溶性物質(zhì)，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組織低溫速凍，利用冷凍