癌基因,腫瘤抑制基因及腫瘤的基因治療

癌基因，腫瘤抑制基因及腫瘤的基因治療朱衛(wèi)國北京大學基礎醫(yī)學院生物化學與分子生物學系Email:zhuweiguo@腫瘤（Cancer,Tumor,Carcinoma）Cancer----惡性腫瘤Tumor---包括良性和惡性腫瘤Carcinoma---上皮來源的惡性腫瘤Sarcoma----間皮來源的惡性腫瘤-oma---良性腫瘤為主如：fibroma,adenoma（hepatoma,melanoma則為惡性）leukemiaNormalcellsCancercellsG1SG2MG0RBApoptosisE2FSurvivalorDeath腫瘤還對臨近組織侵犯，血管破壞，干擾和破壞其他器官的功能，攝取臨近重要組織器官的營養(yǎng)死亡人類對腫瘤認識的過程腫瘍---公元前巖—捻之內(nèi)如山巖，故名之，早治得生，遲則內(nèi)潰肉爛而死癌---明代中醫(yī)---營衛(wèi)不通，邪氣居其中西醫(yī)對腫瘤的認識2500年前有癌的記載1775年----英國醫(yī)生Pott發(fā)現(xiàn)陰囊癌，確立了環(huán)境致癌說1918-1933---日本，英國的科學家證實了環(huán)境致癌說。抽煙---肺癌黃曲霉素---肝癌物理性因素---陽光，X線病毒基因突變分子腫瘤學1969年，HuebnerRJ,TodaroGJ.

OncogenesofRNAtumorvirusesasdeterminantsofcancer.

ProcNatlAcadSciUSA.1969Nov;64(3):1087-94.

Oncogene的提出他們提出：人體細胞中其基因攜帶有內(nèi)在性病毒基因（strange)，這種基因被活化后具有轉(zhuǎn)化細胞的能力Whatis癌基因（oncogene）--并不意味著其在細胞中的作用僅僅是促進腫瘤的發(fā)生。實際上只有當原癌基因發(fā)生突變導致其正常的結構和功能發(fā)生改變，也可以稱原癌基因的活化，進而導致這種活化基因的表達和生物學功能發(fā)生時間和空間的錯位，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展起助進作用。原癌基因都是細胞內(nèi)固有的基因，正常情況下參與細胞的增殖和分化的調(diào)控，只是當基因的結構和功能發(fā)生變異并具有使細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化作用時，才被稱為癌基因。第一個成功分離的病毒癌基因Src(從雞Rous肉瘤)VarmusHE,WeissRA,FriisRR,LevinsonW,BishopJM.Detectionofaviantumorvirus-specificnucleotidesequencesinaviancellDNAs(reassociationkinetics-RNAtumorviruses-gasantigen-Roussarcomavirus,chickcells).ProcNatlAcadSciUSA.1972Jan;69(1):20-4.LevinsonWE,VarmusHE,GarapinAC,BishopJM.

DNAofRoussarcomavirus:itsnatureandsignificance.

Science.1972Jan7;175(17):76-8.Noabstractavailable.

從那時起，提出了“原癌基因”（proto-oncogene)的概念，目前已發(fā)現(xiàn)100多種癌基因包括Ras,c-myc,Bcl-2等。二次突變假說（Two-hit)1971年，Knudson在研究視網(wǎng)膜母細胞瘤時提出了“二次突變”假說。假說認為，在有遺傳傾向的的病人體內(nèi)所有體細胞都存在一種突變，在此基礎上，出生后任何環(huán)境的變化使得基因的另一個等位基因發(fā)生突變而發(fā)生成腫瘤細胞。KnudsonAGJr.

Mutationandcancer:statisticalstudyofretinoblastoma.

ProcNatlAcadSciUSA.1971Apr;68(4):820-3.

人類第一個腫瘤抑制因子(TumorSuppressorGene,or抑癌基因)發(fā)現(xiàn)：Retinoblastoma,Rb，1986。FriendSH,BernardsR,RogeljS,WeinbergRA,RapaportJM,AlbertDM,DryjaTP.AhumanDNAsegmentwithpropertiesofthegenethatpredisposestoretinoblastomaandosteosarcoma.

Nature.1986Oct16-22;323(6089):643-6.腫瘤發(fā)生是細胞內(nèi)多種基因突變累積的的結果OncogeneTumorSuppressorGenesDNARepairGenesONCOGENES(癌基因）RNA腫瘤病毒與病毒癌基因腫瘤病毒DNA病毒：SV40、HPV、EB、乙肝病毒(這些病毒作用于抑癌基因，使其的蛋白功能失活）RNA病毒（逆轉(zhuǎn)錄病毒）RNA腫瘤病毒的分類根據(jù)感染宿主后腫瘤發(fā)生快慢分類：1、急性轉(zhuǎn)化病毒RouseSarcomaVirus潛伏期短（數(shù)周）、可以使培養(yǎng)的細胞癌變。2、慢性轉(zhuǎn)化病毒AvianLeukosisVirus潛伏期長、不能使培養(yǎng)細胞發(fā)生癌變。LTRgagpolenvLTRVirusDNAVirusproteinLTRgagLTRV-oncTransformingVirusDNAVirusprotein逆轉(zhuǎn)錄病毒和攜帶細胞基因序列病毒基因組比較RNA腫瘤病毒是通過激活細胞的原癌基因來起作用的。逆轉(zhuǎn)錄病毒與細胞癌基因活化RNA病毒原癌基因結構異常癌變隨機插入protein1protein2癌基因的分類與功能按功能分：1、生長因子家族v-Sis2、跨膜酪氨酸激酶v-Ros3、膜相關酪氨酸激酶v-Src4、絲氨酸-蘇氨酸激酶v-Raf5、RAS家族v-H-Ras,v-K-Ras6、核蛋白-v-Myc,v-Fos按細胞內(nèi)定位和生物學功能分類：1、生長因子,Int-22、生長因子受體,EGFR3、信號傳導分子,Fas4、轉(zhuǎn)錄因子Myc5、細胞凋亡基因Bcl-26、細胞周期蛋白CDK4腫瘤DNA轉(zhuǎn)化與癌基因的鑒定TumorCellDNAextractionDNAfromtumorcellsNIH3T3CellsScreeningaftertransformationTransformingcellsTransforminggenes但這種方法具有很大的限制性：腫瘤通常是多因素決定，而非單因素；基因轉(zhuǎn)化過程中有人為的基因損傷等因素。癌基因變異方式和活化點突變與癌基因基因點突變是癌基因活化的主要方式。如：H-ras第12位密碼子GGC變?yōu)镚TC,編碼的氨基酸由甘氨酸變?yōu)轭R氨酸，這樣其產(chǎn)物p21-Ras蛋白的結構發(fā)生變化而導致基因的活化。DNA擴增與癌基因細胞內(nèi)一些基因通過不明原因的復制成多拷貝，這些DNA以游離的形式存在稱雙微體（DMS）或再次整合入染色體形成均染區(qū)（HSR），它一般表示染色體結構破壞和不穩(wěn)定性?；蚩截悢?shù)增多往往導致基因表達增多。因此，可以認為基因擴增和過量表達均可影響細胞正常生理功能。癌基因甲基化的改變DNA甲基化狀態(tài)的改變可導致基因結構和功能的改變，是細胞癌變過程中重要的一步。通常發(fā)生在CpG雙核苷區(qū)某些癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化是細胞癌變的一個重要特征。甲基化水平與腫瘤生物學特性密切相關，DNA甲基化水平愈低腫瘤的浸潤能力就越高，臨床分期也愈晚。染色體重排與癌基因最初研究發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤和淋巴細胞白血病中存在免疫球蛋白或T細胞受體基因與未知染色體基因易位。導致一些未知基因易位到免疫球蛋白或T細胞受體。這種排列方式可以導致只在神經(jīng)組織或胚胎細胞中表達的基因在有可能在B細胞或T細胞中表達，這種表達可導致細胞的增殖和分化異常。癌基因與人類腫瘤Ras基因變異與腫瘤分型：N-ras、H-ras、K-ras都編碼鳥苷酸結合蛋白，分子量21000（通常命名為p21）。腫瘤中，以K-Ras

為主，

H-Ras,N-Ras較少見。Ras蛋白在細胞增殖分化信號從激活的跨膜受體傳遞到下游蛋白激酶過程中起重要作用。突變的ras降低了ras蛋白水解GTP為GDP的能力。突變的ras降低了自身內(nèi)源的GTPase的活性，更重要的是降低了它們與GTPase活化蛋白的結合能力。導致ras與GTP持續(xù)結合具有促進細胞增長的作用。Myc基因基因也有三種：C-Myc,N-Myc,L-MycMyc

家族主要在細胞生長調(diào)控中起重要作用。三種蛋白都與特定的序列結合，并與Max蛋白結合形成二聚體而起轉(zhuǎn)錄因子的作用。其中以C-Myc為主.Bcl-2基因與細胞程序化死亡B細胞腫瘤中鑒定出來的癌基因，由染色體[t(14;18)(q32;q21)]異位激活。分布部位：核膜、部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體外膜。分子量：25KDBcl-2基因持續(xù)表達可以延長IL-3依賴性的淋巴細胞在無IL-3培養(yǎng)基中的存活時間。Bcl-2/Bax

形成二聚體干擾細胞凋亡FAS-TNFReceptorDeathrelatedproteinApoptosisproteinaseBcl-2BaxProteindegradationCleavageDamageofcellmembraneBcl-2參與細胞凋亡過程MDM2基因12q13-14,5.5kbmRNA,gene2.372kb,AA491,MDM2p53RB細胞周期蛋白細胞周期受到一系列因子的調(diào)控，其中作主要的是一組cyclin蛋白，它們與細胞周期素依賴性激酶（cyclin-dependentkinase,CDKs）相結合而對細胞周期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。其中，最重要的是G1晚期的R點，通過此點的細胞將不可逆的進入分裂周期。當細胞受到刺激急如周期后最早表達的是cyclinD，它通常與CDK4結合，在有些細胞中與CDK6結合使細胞通過R點。CyclinD/CDK4復合物中cyclinD能夠通過其N端LXCXE序列與Rb結合，在CDK4的作用下，使Rb蛋白磷酸化，使Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F后者激活一系列的基因，促使細胞進入S期?？筩yclinD的抗體可以使大多數(shù)細胞停留在S期前，但cyclin/CDK復合物的這種作用必須有Rb的存在。CyclinD的半衰期很短大約30分鐘，其表達易受外界因素的影響，在生長因子刺激的細胞增殖中，加入生長因子可導致cyclinD1和CDK4在G1期的表達，從反應體系中撤出生長因子會導致cyclinD1的快速降解，并阻止G1期細胞進入S期。因此，人們推測cyclinD上調(diào)導致細胞不在依賴生長因子而與腫瘤發(fā)生有密切關系?，F(xiàn)已經(jīng)證明cyclinD1和cyclinD2的變異可起癌基因的作用。抑癌基因(TumorSuppressorGene,RecessiveOncogene,TumorSusceptibilityGene)確定抑癌基因在理論上需要滿足的三個基本條件1、在惡性腫瘤相應的正常組織該基因必須正常表達。2、在惡性腫瘤中，該基因有功能失活或結構改變或表達缺陷。3、將這種基因的野生型導入基因異常的腫瘤細胞中，可部分或完全改變其惡性表現(xiàn)。

Rb基因

Rb（retinoblastomagene）是第一個被克隆的抑癌基因。1986年，美國的三個實驗室分別獨立的克隆了該基因。

Rb基因，全長約200kb，含27個外顯子，26個內(nèi)含子，外顯子大小不同短的31bp，長的有19kb，轉(zhuǎn)錄的mRNA有4.7kb,編碼928個氨基酸，分子量是105-110kD的核內(nèi)磷酸化蛋白。Rb具有DNA結合活性，表明其能夠參與某些基因的調(diào)節(jié)。p15,p18,p19p57P57一、Rb基因的生物學活性

Rb基因的磷酸化狀態(tài)是Rb基因調(diào)節(jié)細胞生長分化的主要形式。調(diào)節(jié)Rb功能最主要的磷酸化事件在G1和S期交界處。磷酸化的Rb與細胞內(nèi)蛋白結合形成復合物的能力喪失。如，Rb在非磷酸化狀態(tài)下可以與E2F結合，并抑制其活化基因表達的功能。磷酸化的Rb不能與E2F結合。E2F與DP1蛋白形成異二聚體活化一系列由G1期進入S期所必需的基因的表達。二、Rb基因異常與腫瘤

Rb基因異常主要表現(xiàn)為等位基因缺失和基因突變。最初，在視網(wǎng)膜母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)，后來在多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)該基因的異常。其基因異常多發(fā)生在13-17外顯子上。在小細胞肺癌中，異常為50%，骨肉瘤47%，乳腺癌32%.OttersonGA,KratzkeRA,CoxonA,KimYW,KayeFJ.

Absenceofp16INK4proteinisrestrictedtothesubsetoflungcancerlinesthatretainswildtypeRB.

Oncogene.1994Nov;9(11):3375-8.

AmilestonepaperregardingarelationshipbetweentheRBgene’sandothergene’sAberrantInhumancancercells

二次突變假說1971年，Knudson在研究視網(wǎng)膜母細胞瘤時提出了“二次突變”假說。假說認為，在有遺傳傾向的的病人體內(nèi)所有干細胞和體細胞都存在一種突變，在此基礎上，任一視網(wǎng)膜母細胞若再出現(xiàn)第二次突變，即可導致腫瘤發(fā)生。“二次突變”假說的意義1、為解決遺傳性和體細胞突變通過何種機制在腫瘤發(fā)生過程中起作用提供了思路。2、腫瘤細胞發(fā)生過程中隱性遺傳性決定因素與體細胞表型連接起來。p53基因是tumorsuppressorgene一明珠，Pubmed有超過3萬篇論文，篇篇內(nèi)容不同。臨床上，超過50%的腫瘤其p53有異常。1979年，發(fā)現(xiàn)SV40轉(zhuǎn)化的細胞中與SV40-largeT抗原結合，而被誤認為癌基因，直到1989年，才被證實為抑癌基因DeLeoAB,JayG,AppellaE,DuboisGC,LawLW,OldLJ.Detectionofatransformation-relatedantigeninchemicallyinducedsarcomasandothertransformedcellsofthemouse.

ProcNatlAcadSciUSA.1979May;76(5):2420-4.

BakerSJ,MarkowitzS,FearonER,WillsonJK,VogelsteinB.Suppressionofhumancolorectalcarcinomacellgrowthbywild-typep53.Science.1990Aug24;249(4971):912-5.p53基因的結構

p53基因全長20kb，定位于人類染色體17p13.1，由11個外顯子組成，編碼393個氨基酸組成的53kd的核內(nèi)磷酸化蛋白，具有蛋白質(zhì)-DNA和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結合的功能。NC100-300AADNA結合域調(diào)節(jié)domain301-3931-99p53proteinp53基因生物學特性p53是細胞生長周期中的負調(diào)節(jié)因子，與細胞周期的調(diào)控、DNA修復、細胞分化、細胞凋亡等重要的生物學功能有關。p53

基因分型p53

基因分為野生型和突變型，它的表達產(chǎn)物也分為野生型和突變型

野生型p53極不穩(wěn)定，半衰期僅為數(shù)分鐘，并具有反式激活功能和光譜的抑制腫瘤的功能。突變型p53具有癌基因的功能，促進癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化。

p53

基因可以調(diào)節(jié)細胞周期過程中起關鍵作用的基因，包括可調(diào)節(jié)CDK活性的p21基因和DNA損傷導致細胞生長受阻相關的GADD45基因。p53在G1/S期起作用，決定是否啟動DNA合成，而在另外的一些情況確決定細胞是否凋亡。

p53Baxp21CellcyclearrestApoptosisMDM2p14arfManyfactorsGADD45Morethan100proteinsp53

基因異常與腫瘤

p53基因的缺失或突變已經(jīng)被證實是絕大多數(shù)腫瘤發(fā)生的原因之一。