北京化工大學(xué)課件第三章2 高效液相色譜

高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography(HPLC)12高效液相色譜一概述二液相色譜儀三HPLC檢測(cè)器四各種色譜方法五HPLC分離利用3一、概述－定義高效液相色譜以液體作為流動(dòng)相的色譜過(guò)程4一、概述－特點(diǎn)高壓---150~350x105Pa高速---小于1h高效---3萬(wàn)塔板/米（氣相色譜2000塔板/米）高靈敏度---10-9~10-11g5GC與HPLC比較

GCHPLC流動(dòng)相惰性氣體（無(wú)親和性，只起運(yùn)載作用）氣體、沸點(diǎn)較低的化合物不同極性的液體（有一定親和作用）溫度較高一般室溫分析對(duì)象高沸點(diǎn)、不穩(wěn)定的天然產(chǎn)物、生物大分子、高分子化合物6

一、概述-分類(lèi)

(1)分配色譜(2)吸附或液固色譜(3)離子色譜(4)凝膠色譜或尺寸排阻色譜

7二、各種色譜方法（一）分配色譜

（二）吸附色譜（三）離子交換色譜法

（四）排阻色譜法8（一）分配色譜分配色譜液液分配色譜(LLPC)鍵合固定相分配色譜(LSPC)

(PartitionChromatography)液體固定相通過(guò)物理吸附固定于載體表面有機(jī)分子通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面9（一）分配色譜–分離原理分離原理不同組分在兩相間分配系數(shù)不同10（一）分配色譜-固定相固定相---物理吸附（擔(dān)體+固定液）全多孔型擔(dān)體薄殼型微珠擔(dān)體11R---極性基團(tuán)疏水基團(tuán)固定相---化學(xué)鍵合（一）分配色譜-

固定相12HPLC的固定相的化學(xué)構(gòu)造非鍵合相表面鍵合相表面ODCC18C8C1Phenyl-NH2-CN13正相分配色譜反相分配色譜固定相性質(zhì)極性非極性鍵合基團(tuán)

極性基團(tuán)疏水基團(tuán)流動(dòng)相性質(zhì)非極性極性出峰順序極性小先出極性大先出14（二）吸附色譜–分離原理分離原理溶質(zhì)與流動(dòng)相分子在吸附劑表面上的吸附競(jìng)爭(zhēng)15（二）、吸附色譜-固定相

以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。固定相16（三）、離子交換色譜固定相為離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹(shù)脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。分離原理固定相17分離對(duì)象離子或可離解的化合物（三）、離子交換色譜（無(wú)機(jī)離子、氨基酸、蛋白質(zhì)等）18（四）排阻色譜法

分離原理根據(jù)樣品分子尺寸大小分離

大分子不能進(jìn)入多孔中，不被保留，隨Vm流出中分子部分進(jìn)入多孔中，一般保留小分子完全進(jìn)入多孔中，長(zhǎng)時(shí)間保留。191.軟凝膠：鉸鏈葡萄糖的多孔聚合物，聚丙烯酰胺凝膠。（凝膠過(guò)濾色譜）2.半硬凝膠：聚苯乙烯珠（凝膠滲透色譜）高硬凝膠和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球，經(jīng)化學(xué)鍵合處理，不隨壓力及溶劑改變尺寸，（高效排阻色譜）

固定相20高分子化合物分子量及分子量分布DNA碎片不同堿基支鏈分離。應(yīng)用（四）排阻色譜法

21極性水不溶性水溶性非極性物質(zhì)離子極性非離子型排阻凝膠滲透凝膠過(guò)濾吸附反相分配色譜正相分配色譜分配離子交換HPLC應(yīng)用概圖

22流動(dòng)液貯存提供脫氣輸液泵進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)控制與記錄系統(tǒng)

三、液相色譜儀

23LC系統(tǒng)24251.流動(dòng)相貯存與脫氣

（1）真空泵抽濾系統(tǒng)（2）低溶性惰性氣體導(dǎo)入替換（3）超聲脫氣脫氣方法262.

輸液系統(tǒng)

活塞泵注射泵氣動(dòng)泵27活塞泵工作原理28注射泵

293.進(jìn)樣系統(tǒng)不使整個(gè)壓力變化的情況下將樣品注入色譜柱，通常使用所謂六通閥樣品環(huán)樣品先用0.4微米的濾膜過(guò)濾30樣品環(huán)314、色譜柱柱長(zhǎng)：5cm–25cm內(nèi)徑：3-5mm粒徑：3-5μ

m柱管：不銹鋼32常用的柱子柱長(zhǎng)：15cm或25cm內(nèi)徑：4.6mm粒徑：5μ

m塔板數(shù)：40000-70000plates/meter10000plates/column33微柱柱長(zhǎng)：3cm-7.5cm內(nèi)徑：4.6mm粒徑：3-5μ

m塔板數(shù)：100000plates/meter34保護(hù)柱（guardcolumn)置于分析柱前的短柱，填料與分析柱基本相同，但粒徑略大，避免增大柱壓。用于除去污染物355.HPLC檢測(cè)器

溶液：折光，介電常數(shù)，密度溶質(zhì)：吸光光度，熒光光度，擴(kuò)散電流等（1）.

吸光檢測(cè)器（2）.

紅外檢測(cè)器（3）.

熒光檢測(cè)器（4）.

折光檢測(cè)器（5）.

電化學(xué)檢測(cè)器（6）.

質(zhì)譜檢測(cè)器36常用LC檢測(cè)器

名稱(chēng)使用量商品化靈敏度價(jià)格吸光度71%Yes100pg-1ng1熒光13%Yes1-10pg2-20電化學(xué)4.3%Yes10pg-1ng1-2折光5.4%Yes100ng-1μg1-電導(dǎo)

Yes500pg-1μg1-質(zhì)譜

No

1000FTIR

Yes1μg10005光散射

Yes981ng

光離子化

No1pg-1ng

元素選擇

No10ng

37（1）吸光檢測(cè)器單波長(zhǎng)UV檢測(cè)器，光源用Hg燈