熒光顯微鏡的原理和使用方法課件

特殊顯微鏡的使用（3）

熒光顯微鏡的原理及其應用

一、實驗目的：掌握熒光顯微鏡的原理和使用方法二、實驗原理熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)是熒光顯微術的基本裝置。熒光顯微術是利用一定波長的光（通常是波長短的紫外光和藍紫光）照射被檢樣品，激發(fā)熒光物質發(fā)出可見的熒光。通過物鏡和目鏡的成像、放大，以供檢視和拍攝。熒光顯微鏡具特殊光源，提供足夠強度和波長的激發(fā)光，誘發(fā)熒光物質發(fā)出熒光。視場中所見的像，主要是樣品的熒光映像。2021/12/21熒光顯微鏡的原理和使用方法某些物質經波長較短的光線照射后，分子被激活，吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。其能量部分轉化為熱量或用于光化學反應外，相當一部分則以波長較長的光能形式輻射出來，這種波長長于激發(fā)光的可見光稱作熒光。生物體內有些物質受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出的熒光，稱為自發(fā)熒光（如葉綠體中的葉綠素分子受激發(fā)所發(fā)出的火紅色的熒光）；本身不發(fā)熒光，在吸收熒光染料之后所發(fā)出的熒光稱為次生熒光。常用的熒光染料包括丫啶橙、熒光素、羅丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。細胞內大部分物質經短光波照射后，可發(fā)出較弱的自發(fā)性熒光。有些細胞成分與能發(fā)出熒光的有機化合物——熒光染料結合。激發(fā)后呈現一定顏色的熒光，借以對組織進行細胞化學的觀察和研究。2021/12/22熒光顯微鏡的原理和使用方法2.1熒光顯微鏡的基本裝置及其光路熒光顯微鏡因制造廠家、型號的不同，結構各異，但主要構件，基本相同。2.1.1光源:采用高壓汞燈。汞燈能以最小的表面發(fā)出最大數量的紫外光和藍光，且光亮度大，光度穩(wěn)定。汞燈的構件，中間為一球形石英玻璃管，有兩個鎢電極，內充汞滴和少量氬氖混合氣體。汞燈裝在牢固的燈室中，有調中、聚焦和集光裝置。使用中嚴禁頻繁啟閉，點亮后欲暫停使用時，不可切斷電源，可用光閥阻斷光路。當汞燈熄滅后，不能立刻點亮，經5～10min，汞燈冷卻后再通電點亮。

HBO200Ｗ汞燈的發(fā)射光譜為200～600nm，其中在365nm和435nm處有兩個高峰。2021/12/23熒光顯微鏡的原理和使用方法2.2.2濾色鏡系統(tǒng):熒光顯微術的濾色鏡，按用途或功能，主要分為下列兩類：

激發(fā)濾色鏡（exciterfilter）:激發(fā)濾色鏡的作用，在于為被檢樣品的熒光染料提供最佳波段的激發(fā)光。熒光染料均有一定的吸收光譜（激發(fā)峰值），利用濾色鏡對光線選擇吸收的能力，選用其透射光譜，恰為熒光染料的最大吸收光譜（激發(fā)高峰）的激發(fā)濾色鏡，以便從汞燈發(fā)出的廣譜光波中，選擇透過最宜波段的光線供用。激發(fā)濾色鏡加放于汞燈和二向色鏡（dichoticmirror）之間，物鏡之前。濾鏡的型號不同，數量較多，可按不同需要選用。2021/12/24熒光顯微鏡的原理和使用方法阻斷濾色鏡（barrierfilter）:阻斷濾色鏡位于物鏡之上，二向色鏡和目鏡之間，用以阻斷或吸收光路中的激發(fā)光或某些波長較短的光線，以防傷害眼睛，使熒光透過。選用的原則，以能完全阻斷或吸收波長短于所需熒光的光線，并透過樣品發(fā)出的熒光。所以，阻斷濾色鏡的選用，應視熒光染料的熒光光譜而定，以能最大限度地透過熒光和阻斷短波光。2021/12/25熒光顯微鏡的原理和使用方法二向色鏡（chromaticbeamsplitter）:熒光顯微鏡中，除上述兩類濾色鏡外，尚有一重要的分色鏡系統(tǒng)——二向色鏡位于汞燈汞激發(fā)濾色鏡構成的水平光軸與目鏡和物鏡構成的豎直光軸的兩軸垂直相交處，斜向安裝于光路之中。由鍍膜的光學玻璃制成，其鏡面方位與上述兩光軸交角均呈45°，兼有透射長波光線和反射短波光線的功能。在熒光顯微術中承當色光的“分流”作用。2021/12/26熒光顯微鏡的原理和使用方法2.2.3熒光顯微鏡的光路熒光顯微鏡的光學原理圖根據照明方式的不同，熒光顯微鏡分為落射式熒光顯微鏡和透射式熒光顯微鏡兩種。目前常用的是落射式熒光顯微鏡，特點是光源通過物鏡落射于樣品，激發(fā)產生的熒光再通過物鏡進入目鏡。透射熒光顯微術光路:透射熒光顯微術是激發(fā)光束通過聚光器自下而上的透射樣品，誘發(fā)的熒光從物鏡前方進入物鏡。汞燈發(fā)出的強光經集光透鏡、吸熱濾色鏡、鏡臂反光鏡、激發(fā)濾色鏡、光路轉換反光鏡后光線轉射向上，進入視場光闌，暗視場聚光器，進入樣品，激發(fā)出的熒光射入物鏡經阻斷濾色鏡進入目鏡。2021/12/27熒光顯微鏡的原理和使用方法反射熒光顯微術的光路:反射熒光又稱落射熒光，因激發(fā)光由物鏡后部進入物鏡，向下落射樣品，激發(fā)出熒光，熒光反射向上再進入物鏡。其光路如圖3-1和3-2所示。汞燈發(fā)出高強的激發(fā)光，經集光透鏡，吸熱玻璃，孔徑光闌，激發(fā)濾色鏡，視場光闌，通過二向色鏡，在此處一定波長以上的長波光線透過二向色鏡，脫離光路，一定波長以下的短波光線反射向下進入物鏡，透過物鏡射向樣品，激發(fā)熒光物質發(fā)出可見的熒光，熒光反射向上再次進入物鏡，復經二向色鏡其中波長較短的光線反射至光源方向，熒光和長波光線透射向上經阻斷濾色鏡進入目鏡。熒光顯微鏡的光學原理見圖3-3：

2021/12/28熒光顯微鏡的原理和使用方法圖3-1落射熒光顯微鏡光路圖2021/12/29熒光顯微鏡的原理和使用方法圖3-2落射熒光顯微鏡光路圖2021/12/210熒光顯微鏡的原理和使用方法

圖3-3熒光顯微鏡的光學原理 2021/12/211熒光顯微鏡的原理和使用方法熒光的種類自發(fā)熒光（固有熒光）

二次熒光2021/12/212熒光顯微鏡的原理和使用方法熒光顯微鏡的類型1、透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉射和旁射到標本上．這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數增加其熒光減弱．所以對觀察較大的標本材料較好。

2021/12/213熒光顯微鏡的原理和使用方法透射式熒光顯微鏡效果圖2021/12/214熒光顯微鏡的原理和使用方法透射式熒光顯微鏡光路圖2021/12/215熒光顯微鏡的原理和使用方法2．落射式熒光顯微鏡

：這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡(圖2―6)。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45°角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片／雙色束分離器／阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強2021/12/216熒光顯微鏡的原理和使用方法2021/12/217熒光顯微鏡的原理和使用方法熒光顯微鏡內部構2021/12/218熒光顯微鏡的原理和使用方法落射熒光顯微鏡光路圖2021/12/219熒光顯微鏡的原理和使用方法使用方法(1)高壓汞燈的調中：汞燈調中檢驗器似物鏡狀，使用時將其全部旋入物鏡轉換器，中部有一圓形屏，能映現汞燈的電弧像，用以觀察調中。按通電源，按壓啟動鈕，點亮汞燈。完全開放視場光闌和孔徑光闌。轉動汞燈室右側的水平和垂直調中螺旋，通過調中器圓形屏觀察，至調中器內部被充分照明止。旋轉集光透鏡調焦鈕，使汞燈電弧像聚焦，再用調中螺旋將電弧像驅于水平對稱位置（調中）。2021/12/220熒光顯微鏡的原理和使用方法(2)光吸收器的組裝：反射式熒光裝置無需聚光器，由一底部封閉的圓筒狀的光吸收器取代，用以吸收射入的光線，防止四射。組裝方法：降下聚光器架，將光吸收器插入楔形神內，固緊、回升最高位。2021/12/221熒光顯微鏡的原理和使用方法(3)操作程序轉動鏡臂旋轉臺，至相應的標志位。旋轉臺為一圓盤狀結構，上有5個定位標志：U、V、B、G、O，分別代表不同的熒光激發(fā)方法及其不同的濾色鏡系統(tǒng)組合。點亮汞燈，接通電源，按壓啟動器按鈕，使汞燈點亮。將鏡臂左側的DIA轉換鈕調至EPI位。確認汞燈點亮，照明系統(tǒng)正確，燈位調中，電弧像聚焦準確。用熒光染料染色的樣品，放在載物臺上，用10×物鏡聚焦?？讖焦怅@的調整使用：光闌位于鏡臂中，用外露手桿操縱。在汞燈調中、聚焦時，光闌應全開。熒光顯微時，孔徑應縮小，使之小于視場。2021/12/222熒光顯微鏡的原理和使用方法

視場光闌的調整使用：視場光闌位于孔徑光闌之后，亦由外露手桿操縱。視場光闌用于限定樣品表面的照明區(qū)域，其開度一般應與孔徑光闌的開孔相當。輔助激發(fā)濾色鏡滑動閥的使用:滑動閥位于鏡臂專用槽中，可拉出或推入。有三個擋位供不同使用。全拉出位：供常規(guī)使用；中間位：用于Ｂ激發(fā)法，輔助濾色鏡進入光路；全推入位：用作光閥，阻斷全光線．激發(fā)方法：共有四種激發(fā)方法：紫外、紫、藍和綠激發(fā)法，各適用于各種不同的熒光染色方法。2021/12/223熒光顯微鏡的原理和