蛋白裂解液之歐陽科創(chuàng)編

歐陽科創(chuàng)編 歐陽科創(chuàng)編 2021.02.05歐陽科創(chuàng)編 歐陽科創(chuàng)編 2021.02.05蛋白質(zhì)的定位與蛋白質(zhì)裂解液的選擇 :全細(xì)胞：NP-40或RIPA細(xì)胞質(zhì)（可溶）：Tris-HCl細(xì)胞質(zhì)（細(xì)胞骨架）:Tris-Triton細(xì)胞膜：NP-40或RIPA細(xì)胞核：RIPA線粒體：RIPA創(chuàng)作：歐陽科時間：2021.02.05創(chuàng)作：歐陽科RIPA裂解液配方lmlRIPAbuffercontains35plproteinaseinhibitorand10plphosphataseinhibitorRIPAbuffer最終濃度IMTris-HCl(pH7.5)5ml50mMNaCl0.87g0.15MNa-deoxycholaleo.ig(0.1%)0.5MEDTA(pH8.0)0.8mlNaF41mgNonidetP401ml(1%)Aprotnuii1Opg/jilloomlOng/ml加水到100mlAprotinin10|ig/pl；用lOmMHEPES-KOH(PH8.0)溶解，備用。?NonidetP-40簡稱NP-40,乙基苯基聚乙二醇，常用非離子性去垢劑。.Na-deoxycholale,脫氧膽酸鈉，離子型去垢劑。離子型去垢劑主要作用有:裂解細(xì)胞；溶解蛋白，尤其是可以溶解—些難溶于水的蛋白，如膜蛋白等；很適合做WB,但在Co-IP中使用，需要謹(jǐn)慎。?亮抑霉肽(Leupeptin):抑制絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、纖溶酶、豬胰激肽原酶)和半胱氨酸蛋白酶(包括木瓜蛋白酶和組織蛋白酶B)?抑肽素A(PepstatinA)抑制各種天門冬氨酸蛋白酶，例如組織蛋白酶D、腎素、胃蛋白酶、細(xì)菌天門冬氨酸蛋白酶和HIV蛋白酶；?胰凝乳蛋白酶抑制劑(Chymostatin)抑制具有糜蛋白酶類特異性絲氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶、胃促胰酶、組織蛋白酶G)和大多數(shù)絲氨酸蛋白酶(包括組織蛋白酶B,H,L)?抗木瓜蛋白酶(Antipain)抑制木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和纖溶酶。?氟化鈉抑制酸性磷酸酶?正帆酸鈉:抑制堿性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶(tyrosinephosphatase)?焦磷酸鈉(sodiumpyrophosphate):抑制絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶(serine-threoninephosphatase)。在與蛋白相關(guān)的檢測中，首先最關(guān)鍵的一步便是蛋白質(zhì)的提取。蛋白質(zhì)的提取過程中，我們要經(jīng)常加和蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)的降解。另外在磷酸化蛋白的研究過程中，磷酸酶抑制劑也是必不可少的，本文總結(jié)了常用的蛋白酶抑制劑PMSF,Leupeptin亮肽素,Aprotinin抑肽酶，Pepstatin胃蛋白酶抑制劑，EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制劑NaF氟化鈉，Na3VO4原磯酸鈉，BETA-glycerophosphate甘油磷酸鈉，Na2P2O4焦磷酸鈉等。對這些蛋白酶抑制劑的溶解配制，貯存液與工作液濃度，保存都做了詳細(xì)的說明。蛋 白 酶 抑 制 劑PMSF:特性：絲氨酸蛋白酶抑制劑，如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶(可逆的地面處 理)。溶解性：溶于異丙醇，乙醇，甲醇和丙二醇果〉10mg/mlo在水溶液中不穩(wěn)定。在1000異丙醇，十25C。時穩(wěn)定至少9個月分子量：174.2使用：貯存濃度：200mM,工作濃度：ImMLeupeptin亮肽素特性：抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，纖溶酶，和組織蛋白酶B溶解性：高度溶于水(lmg/ml)。4C。一周穩(wěn)定，分成小份冷凍在-20C。至少6個月分子量：C20H38N6O4x1/2 H2SO4:475.6C20H38N6O4x1/2H2SO4xH2O:493.6使用:貯存濃度：lmg/ml,工作濃度0.5ug/ml(ImM)Aprotinin抑肽酶特性:絲氨酸蛋白酶抑制劑，抑制纖維蛋白溶酶，激肽釋放酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。溶解性：易溶于水(10mg/ml)或緩沖液(例如，tris,0.1M,pH8.0)opH約7?8的溶液在4C?？杀４?周，分裝保存在-20C?？芍辽俦４?個月。避免反復(fù)凍融，pH>12.8的堿性環(huán)境可使其滅活。分子量:6,512使用:貯存濃度：lmg/ml,工作濃度:0.06-2.0ug/ml(0.01-0.3uM)Pepstatin胃蛋白酶抑制劑特性：抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶，腎素，組織蛋白酶D,凝乳酶，許多微生物酸性蛋白酶溶解性：溶于甲醇約lmg/ml；可溶于乙醇，過夜溶解可達(dá)到1mg/ml；在6當(dāng)量乙酸中溶解度為300ug/mlo4C。穩(wěn)定—周，分裝儲存于?20C。時可保存1個月分子量:685.9使用：貯存濃度：lmg/ml,使用濃度：0.7ng/ml(lpM)EDTA-Na2特性：金屬蛋白酶抑制劑溶解性：溶于水至0.5M,在pH8-9的條件下，4C。穩(wěn)定至少6 個 月分子量372.24使用:工作濃度：0.2-0.5mg/ml(0.5-1.3mM),不需現(xiàn)用現(xiàn)配，在溶液pH值調(diào)至8-9時再加入。NaF氟化鈉溶解性 :溶于 水分子量: 41.99使用：貯存液：5M工作濃度：10?20mMNa3VO4原磯 酸鈉酸酶抑制 劑

分子量：183.91溶解性:溶于水，我們購買過來的是原磯酸鈉?原磯酸鈉需要經(jīng)過處理以后才能成為激活的磯酸鈉，激活的磯酸鈉才具有抑制去磷酸化的作用?原磯酸鈉變成激活的磯酸鈉的過程是:100mM原磯酸鈉激活儲存液配制⑴.取0.183克的原磯酸鈉溶解于10ml的雙蒸水中，加酸調(diào)節(jié)PH至10( 顏色變 黃)⑵.煮至無色⑶.室M曰znn冷卻⑷.重調(diào)PH至10⑸重復(fù)（1）(2)(3) (4)直至溶液保持無色，并且PH穩(wěn)定于10份裝100ul/管,每10ml裂解液加一管.（終濃度為lmM）,-20度保存.使用：貯存液：100mM工作濃度：ImMBETA-glycerophosphate甘油磷酸鈉溶解性■?溶 于水分子量??306.11使用：貯存液：100mM工作濃度：25mMNa2P2O4焦礴酸鈉溶解性溶 于水分 子 量： 265.9貯存液：100mM,工作濃度：1-2mMSDS,NP-40,TritonX-100這三種去垢劑的作用是不同的，或者說作用力量強(qiáng)弱不同。SDS屬于離子型去垢劑，最厲害，基本可以把細(xì)胞完全破掉，DNA會釋放出來，裂解液變得很粘稠。NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40,也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一，在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會使蛋白變性失活）。BrijBufferITris-HCl(IM,pH7.5)1millilitre(ml)EDTA(0.5M)0.4millilitre(ml)NaCl(