六動物干細胞

第十五章動物干細胞技術(shù)

2012.10

主要內(nèi)容

序言干細胞的定義、分類、定位干細胞的生物學及形態(tài)學特征干細胞的分離純化和培養(yǎng)干細胞研究意義干細胞的應(yīng)用前景

動物干細胞技術(shù)指通過各種方法獲得干細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)建立細胞系，并對其進行定向分化誘導研究，以期獲得需要的某一特定類型細胞。干細胞研究歷史始于19世紀，至今已有1個世紀。1896年，Wilson在一篇論述細胞生物學的文獻中，首次使用“干細胞”這一概念，專門用于描述寄生蟲生殖系的祖細胞。1981年，Evans和Kaufman用延遲胚胎著床的方法分離胚胎內(nèi)細胞團，首次成功分離得到小鼠胚胎干細胞。2007年，科學家將成年小鼠體細胞誘導逆轉(zhuǎn)成干細胞，更加為干細胞技術(shù)研究提供了新的思路。干細胞研究意義(1)干細胞通過核移植或胚胎嵌合，能得到克隆動物，這對提高優(yōu)良家畜的繁育效率及拯救瀕危動物具有重要意義。(2)由于可以對干細胞進行體外遺傳操作、選擇和凍存而不失其多能性，所以在特定條件下可誘導分化為人們所需要的細胞、組織和器官等并用于臨床治療。(3)干細胞技術(shù)在生物學基礎(chǔ)研究、農(nóng)業(yè)以及移植醫(yī)學上具有廣闊的應(yīng)用前景，其研究成果必將引起人類臨床醫(yī)學的一場革命。1、干細胞的定義、分類、定位1.1定義干細胞(stemcells,SC)：是一類具有無限增殖和自我修復(fù)能力(self-renewing)的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞，存在于個體的不同階段以及成體的不同組織中?；咎卣鳎鹤晕倚迯?fù)多向分化潛能1.2

分類：1.2.1根據(jù)細胞分化潛能的大小分為全能干細胞(totipotentstemcells)

三胚層多能干細胞(pluripotentstemcells)

單胚層多能干細胞(multipotentstemcells)

單能干細胞(monopotentstemcells)全能干細胞：單個細胞如能發(fā)育成一個完整的個體，就稱該細胞的這種潛能為全能性。三胚層多能干細胞

：指細胞失去了發(fā)育成完整個體的能力，但仍具有分化成個體中各種細胞的潛能。單胚層多能干細胞：只能分化成幾種特定類型的細胞，如間充質(zhì)干細胞通常只能分化成骨、肌肉、軟骨、脂肪及其他結(jié)締組織，而不能分化為除此之外的其他組織。單能干細胞：只能分化為一種細胞，如成體干細胞中的神經(jīng)干細胞，只能分化為神經(jīng)元，而不能分化為顯形膠原或少突膠原，這種細胞稱為單能干細胞。1.2.2根據(jù)細胞來源不同分為胚胎性干細胞(embryonicstemcell，ES細胞)

成體干細胞(adultstemcells)

（1）胚胎性干細胞

ES細胞：指源于囊胚內(nèi)細胞團(innercellmass，ICM)的胚胎干細胞(embryonicstemcells,ES)

。

EC細胞：從畸胎瘤中分離得到的多能性細胞(embryoniccarcinormacells，EC)。

EG細胞：胚胎生殖細胞，從早期胎兒原始生殖細胞(primordialgermcells，PGCs)中分離到的細胞(embryonicgermcells,EG）。均屬三胚層干細胞。

（2）成體干細胞

定義：成體干細胞是指一些具有組織特異性的細胞，它們主要用于維持細胞功能的穩(wěn)定，具有修復(fù)和再生能力，能夠產(chǎn)生新的干細胞，或者能按一定的程序分化，形成新的功能細胞，使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。

成體干細胞分類：造血干細胞：存在于骨髓、外周血和臍帶血中，用于治療血液系統(tǒng)疾病以及多種實體腫瘤。神經(jīng)干細胞：存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進一步分化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些細胞類型。間充質(zhì)干細胞：存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，由于它具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉及肌腱等組織分化的潛能，因而利用它進行組織工程學研究。表皮干細胞：位于表皮基底層，具強大的增殖分化潛能，在體外可以分化成表皮全層細胞。表皮干細胞作為組織工程皮膚的種子細胞，已經(jīng)在治療燒傷方面發(fā)揮作用。2.干細胞的生物學特性及形態(tài)學特征

2.1干細胞的生物學特性①終生保持未分化或低分化狀態(tài)；②機體的數(shù)目、位置相對恒定；③具有自我更新能力；④能無限分裂增殖，干細胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內(nèi)處于靜止狀態(tài)；⑤具有多向分化潛能，能分化為各種不同類型的組織細胞，即具有分化發(fā)育的可塑性；⑥分裂周期慢，絕大多數(shù)細胞處于G0期；⑦干細胞通過兩種方式生長：

對稱分裂，形成兩個相同的干細胞，

非對稱式分裂，非對稱式分裂中一個保持親代的特性，仍作為干細胞保存下來，另外一個干細胞不可逆的走向分化的終端成為功能專一的分化細胞。

2.2干細胞的形態(tài)學特征

(1)ES細胞來自正常的胚胎，具有完整的二倍體核型。(2)胞體體積小、核大、胞漿少、有1～2個核仁，細胞緊集于一起，界限不清，呈集落型生長，形似鳥巢，集落邊緣清晰，折光性強。(3）可以表達早期胚胎細胞特異表達的基因，如堿性磷酸酶基因(AKP)、高端粒酶基因活性。從基因表達看，ES細胞類似晚期ICM細胞。(4）具有無限增殖能力。在適宜條件下，如放在飼養(yǎng)層上或含有分化抑制因子的培養(yǎng)基中，細胞可穩(wěn)定傳代，長期培養(yǎng)。(5)廣泛的體外分化能力。當在培養(yǎng)環(huán)境中去除分化抑制因素或加入誘導分化物時，ES細胞可分化成來自三個胚層的細胞。(6)廣泛的體內(nèi)分化能力。將ES細胞接種到同種動物或小鼠體內(nèi)，可分化產(chǎn)生由多種不同組織組成的畸胎瘤，包括來源于三個胚層的細胞。(7)具有種系傳遞功能。若把ES細胞注射到受體胚胎內(nèi)，ES細胞可廣泛參與胚胎各組織和器官、甚至胚胎生殖細胞的發(fā)育，形成種系嵌合體。(8)可在體外培養(yǎng)、克隆、凍存及進行遺傳操作（如導入基因、標記基因或剔除基因），因此可以通過它制備轉(zhuǎn)基因、基因缺失、突變、過表達的雜合或純合動物，并可進行各種基因功能分析。3、干細胞培養(yǎng)建系技術(shù)

3.1ES細胞的來源早期胚胎；從終止妊娠早期的胎兒組織中可分離出多能性干細胞；體細胞核移植胚胎。

（將去核的卵細胞與特定的單個體細胞用電融合法或化學融合法使兩細胞相融合，細胞分裂發(fā)育并形成胚囊，然后分離內(nèi)細胞群，獲得胚胎干細胞）。

3.2ES細胞的分離純化

3.2.1

概念細胞分離(cellisolation)：指將組織材料分散制成組織懸液后，從中獲取目的細胞的過程。細胞純化(cellpurification)：更強調(diào)從原代培養(yǎng)前成分混雜的異質(zhì)性細胞懸液中，或者從培養(yǎng)物中獲得單一類型細胞的過程。3.2.2ES的分離全胚培養(yǎng)法機械剝離培養(yǎng)法酶學解離培養(yǎng)法免疫外科法克隆法全胚培養(yǎng)法

將桑椹胚或囊胚直接培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上，讓其自然脫去透明帶，貼壁，與滋養(yǎng)層細胞一起增殖。當ICM增殖垂直向上生長一定時間后，挑出ICM，并離散成小細胞團塊，進行繼代培養(yǎng)，克隆擴增。

機械分離法

采用機械方法除去胚胎滋養(yǎng)層細胞來分離培養(yǎng)ICM。

用吸管或針頭捶打;

用組織研磨器或注射器研磨;

用不銹鋼或尼龍篩網(wǎng)搓洗等。

按照組織內(nèi)部同細胞的大小差異以一定孔徑的不銹鋼或尼龍篩網(wǎng)過濾細胞起到對細胞進行初步分離純化的作用。酶學解離技術(shù)

包括用胰蛋白酶及鰲合劑處理、用緩沖液浸泡等。此法主要依據(jù)不同組織的細胞和間質(zhì)的構(gòu)成不同。免疫外科法首先用鏈霉蛋白酶將胚胎的透明帶除去，裸胚在抗體中處理一段時間后，再在補體中作用一段時間，使滋養(yǎng)層細胞發(fā)生溶解，然后直接對ICM進行培養(yǎng)與擴增。免疫外科法可選擇性的殺死胚囊外層的滋養(yǎng)層細胞，而僅保留內(nèi)細胞中的團細胞。

克隆法將成纖維細胞或轉(zhuǎn)基因的成纖維細胞注入去核的哺乳動物卵母細胞中，電融合或化學融合并激活，重組胚分裂至桑椹胚或囊胚，分離ES細胞與全胚培養(yǎng)法相同。

以小鼠ES細胞分離為例：

（1）將胚泡與兔的抗小鼠的血清共同孵育一段時間；（2）加入補體；（3）在補體作用下外層的滋養(yǎng)層細胞發(fā)生溶解（內(nèi)細胞團細胞不受影響）；（4）胚泡內(nèi)細胞團在體外適宜的生長條件下形成多種細胞集落；（5）篩選出未分化的細胞集落，培養(yǎng)形成ES細胞系。3.3間充質(zhì)(messenchymalstemcell,MSC)干細胞的分離純化差速貼壁法：利用不同細胞貼壁時間不同進行分離的方法（基于不同黏附特性的細胞分離方法），如利用成纖維細胞、星形膠質(zhì)細胞和成鞘細胞的貼壁時間不同而將它們分離。如：葡聚糖凝膠G-10常用來分離細胞，其原理即利用細胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝膠，從而將異質(zhì)性細胞懸液中具有黏附能力的細胞去除。密度梯度離心法：利用不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。

葉錦等(2010),利用密度梯度離心法和差速貼壁法獲得了高純度的肌源性干細胞，并成功擴增。范萍等(2010),證明貼壁篩選法是理想的體外分離擴增骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的培養(yǎng)體系，所培養(yǎng)的BMSCs純度高、生物學性狀穩(wěn)定。肖宏濤等(2010),利用貼壁法分離了人臍帶間充質(zhì)干細胞。3.4干細胞培養(yǎng)方法飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法3.4.1

飼養(yǎng)層細胞培養(yǎng)法(1)常用飼養(yǎng)層：小鼠胚胎成纖維細胞、STO細胞小鼠胚胎成纖維細胞（mouseembryonicfibroblast,MEFs）

MEF作用:能抑制胚胎干細胞自主分化、有效促進胚胎干細胞增殖，并維持其未分化的二倍體狀態(tài)和全能性。(2)MEF飼養(yǎng)層細胞的制備

MEF的分離：將性成熟雌小鼠(7～8周齡)與種雄鼠(8周齡以上)2:1合籠，每天早上觀察雌小鼠生殖道口，有陰道栓形成即確定受孕，見栓當天為懷孕0.5d；取妊娠12.5～14.5d的孕鼠,斷頸處死,無菌取出胚胎,洗除殘余血跡；去除胚胎頭、四肢、內(nèi)臟，剪軀干成1mm3碎塊，吸至離心管內(nèi)，加入等體積胰蛋白酶-EDTA消化液，吹打30次；細胞離散后,加入等體積MEF培養(yǎng)液，終止消化；800～1000r/min離心5min，棄上清液；加入5mL左右MEF培養(yǎng)液重懸鼠胚組織，制成細胞懸液,記數(shù)。

MEF的培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：調(diào)整細胞濃度,接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)（一般5個鼠胚可使用1個100-150mL培養(yǎng)瓶），讓組織懸液能均勻覆蓋培養(yǎng)瓶表面，于37℃、5%CO2、飽和濕度，孵箱培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：待成纖維細胞基本鋪滿培養(yǎng)皿底，用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化吹打，置離心管靜置5min,取上層液制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106～2×106個/mL（1:3比例），進行傳代培養(yǎng)，一般采用3～5代作飼養(yǎng)細胞用。

MEF飼養(yǎng)層的制備：絲裂霉素C處理法、γ線照射法。一定劑量的絲裂霉素C（有絲分裂抑制劑）和γ射線能夠使細胞停止分裂，但又不立即死亡，在體外可維持一段存活時間。用這兩種方法處理飼養(yǎng)層細胞，可使飼養(yǎng)層細胞不分裂，又能存活，并分泌抑制ES細胞分化和促進ES細胞增殖的因子，保證ES細胞的生長。MEF飼養(yǎng)層的制備：方法：絲裂霉素C處理法（有絲分裂抑制劑）、γ線照射法。作用：使細胞停止分裂，但又不立即死亡，并分泌抑制ES細胞分化和促進ES細胞增殖的因子，保證ES細胞的生長。

絲裂霉素C法：

a.選取MEF細胞生長旺盛的培養(yǎng)皿,加入絲裂霉素C10μg/mL（覆蓋細胞單層即可），處理2～3h；

b.吸去處理液，用PBS標準培養(yǎng)液清洗2-3次,除去殘余絲裂霉素C

；

c.用0.25%胰酶、0.04%EDTA消化制成單細胞懸液,計數(shù)、調(diào)整細胞濃度為3.0×105個/mL，接種到用0.1％明膠預(yù)處理過的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。

d.37℃、5％C02、100％濕度孵箱培養(yǎng)，細胞很快貼壁并鋪展為單層。這樣制成的飼養(yǎng)單層可使用6～10d，使用前更換成ES培養(yǎng)液，其它細胞飼養(yǎng)層的制備方法基本同于MEF的制備。

γ射線處理法:

MEF或STO融合成單層后，用γ射線照射，劑量為30-100Gy，余下步驟同絲裂霉素C處理法。

（3）小鼠纖維母細胞（STO細胞）培養(yǎng)STO：SIM小鼠纖維母細胞的一種耐硫代鳥嘌呤（T）和耐鳥苯苷（O）亞系細胞。分泌：干細胞生長因子（stemcellgrowthfactor，SCGF）白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor，LIF）抑制干細胞分化。STO代替MEF的優(yōu)點：細胞易于生長及不需要經(jīng)常準備懷孕母鼠，但STO細胞必須保持在最適生長條件下，否則易于變異。目前已有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了neor基因和UF基因的STO細胞株(如SNL細胞)，可用于ES細胞的轉(zhuǎn)染和篩選。培養(yǎng)按一般細胞株，培養(yǎng)液同MEF。

3.4.2無飼養(yǎng)層培養(yǎng)(1)基本原理在細胞培養(yǎng)液中添加ES細胞抑制分化因子，使ES細胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下保持未分化狀態(tài)。

(2)培養(yǎng)基的組成

a.常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM、TCM-199、F-12等。

b.常用三種ES細胞培養(yǎng)液重組的LIF---白血病抑制因子，具有抑制胚胎干細胞自主分化的能力。BRL（Buffalo大鼠肝細胞株）條件培養(yǎng)基---能分泌一種抑制畸胎瘤和胚胎干細胞自主分化的因子。大鼠心肌條件培養(yǎng)基---能顯著促進胚胎干細胞的貼壁和生長。(3)ES細胞培養(yǎng)中常用添加物

血清巰基乙醇非必需氨基酸核苷酸

亞硒酸鈉和其他各種因子(4)ES細胞培養(yǎng)中常用的外源生長因子表皮生長因子(EGF)

堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)

干細胞生長因子(SCF)

胰島素樣生長因子(IGF)等。(5)培養(yǎng)方法

酶消化法：待胚胎發(fā)育至囊胚或孵化胚后，分離ICM細胞，實體顯微鏡下挑取形態(tài)典型的ICM集落；用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化3～5min，轉(zhuǎn)入ES細胞培養(yǎng)液中進行剝離ICM細胞；用孔徑適當?shù)奈吖艽荡?，制成單細胞或小細胞團塊，轉(zhuǎn)入條件培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

3.5ES細胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)

3.5.1ES細胞的原代培養(yǎng)制備好MEF飼養(yǎng)層并添加相應(yīng)的ES細胞培養(yǎng)液，隔日將囊胚置入培養(yǎng)；培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、飽和濕度。挑取生長良好，沒有分化跡象的ES/EG集落進行消化擴增。用胰蛋白酶消化巢狀胚胎干細胞團,繼續(xù)培養(yǎng)，一般間隔4～5d用胰蛋白酶消化成小細胞團塊或單細胞，克隆和純化ES細胞。3.5.2ES細胞的傳代培養(yǎng)初次傳代后2～3d后將會出現(xiàn)小的ES細胞集落，待ES細胞集落充分增殖而不出現(xiàn)分化時重新離散，轉(zhuǎn)入新鮮飼養(yǎng)層上。經(jīng)數(shù)次分離純化后，ES細胞逐漸擴增，每隔4～6d傳代一次。對ES／EG細胞進行消化傳代總的原則是：盡量縮短酶消化作用時間，將細胞的損傷降到最低程度，且能將集落消化成小細胞團塊。CDB猴ES細胞A貼壁培養(yǎng)的類ES細胞；B酶消化處理后的ES細胞；C吸管吹打后形成的細胞簇；D傳代培養(yǎng)后1d形成的ES細胞集落（引自KursadTurksen.《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd）,2006）3.6ES細胞的冷凍與解凍

在ES細胞傳代過程中，需要不斷對細胞進行冷存。因為ES細胞的耐受性差，應(yīng)采用“慢凍-快溶”的方法，即冷凍時不宜過快，以保持ES細胞解凍后最大的存活率。取材處理：取對數(shù)生長期的ES單細胞懸浮液放入冷凍液中。冷凍液：

75%DMEM+15%新生牛血清(NCS)+10%DMSO（用時配制）冷凍：冷凍開始溫度下降速度保持在13℃／min為宜，當溫度下降到－20℃左右時，下降速度可調(diào)為5℃／min，到－100℃左右時，可迅速投入液氮中。解凍：從液氮中取出冷凍管，投入37℃水浴至全部溶解，75％的酒精消毒冷凍管外壁，立即加入ES細胞培養(yǎng)液，離心2次除去冷凍液，棄去上清，以培養(yǎng)液重新懸浮細胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3.7ES和EG細胞系的特性和鑒定

3.7.1ES/EG細胞系的特性（1）無限增殖性在不分化前提下，ES細胞體外培養(yǎng)增殖迅速，每18～24h增殖一次，細胞隨著增殖次數(shù)的增加而活力并不減弱，增殖過程中細胞大多處于S期，進行DNA合成。（2）分化潛能性高分化潛能：具有高度分化潛能，可分化形成包括三個胚層在內(nèi)的各種類型細胞（血細胞、內(nèi)皮細胞、肌細胞和神經(jīng)細胞等）。定向分化：

ES細胞在體外某些物質(zhì)誘導下可以發(fā)生定向分化，如用造血基質(zhì)細胞、不同造血生長因子對單層培養(yǎng)的ES細胞進行誘導分化，可形成各階段的造血細胞。（3）種系傳遞性將ES細胞注入囊胚后發(fā)育，可獲得嵌合體，并參與生殖細胞的形成。在嵌合體中一部分組織和細胞來源于受體囊胚細胞，而另一部分來源于ES細胞?；谄浞N系傳遞特性，可在ES細胞水平進行基因打靶等操作，研究基因在個體發(fā)育中的作用。3.7.2ES/EG細胞的鑒定

ES/EG細胞經(jīng)分離培養(yǎng)，最終建立細胞系，需要根據(jù)其細胞特性進行一系列鑒定，以了解是否分化變異、干細胞的特性或能力是否喪失。鑒定方法：形態(tài)學特征；特異性標志分子的表達；分化潛能測定。1.形態(tài)學特征

ES細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、核型特征：ES細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)(胞體體積小、核大、有一個或幾個核仁)和生長特性(呈克隆狀生長,細胞緊密聚集,形似鳥巢,界限不清等)對ES細胞鑒定。不同ES細胞形態(tài)不同，鼠ES細胞集落一般呈緊密的球形，靈長類動物的ES細胞集落相對較為扁平。2.細胞表面標志鑒定Oct4基因：已分化細胞不表達Oct4AKP：未分化ES細胞表面標記AKP呈強陽性，反之則AKP呈陰性。SSEA：未分化干細胞中SSEA為陽性，反之呈陰性。(1)堿性磷酸酶的表達堿性磷酸酶(AKP)常用來作為鑒定EC細胞或ES細胞分化與否的標志之一，可用AKP染色的方法進行AKP檢測。(2)胚胎階段特異性細胞表面抗原的表達早期胚胎細胞表面均表達胚胎階段特異性表面抗原(SSEA-1)。

(3)Oct-4轉(zhuǎn)錄子表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄因子Oct-4在多能胚胎干細胞和原始生殖細胞中得到表達。當全能細胞分化形成體細胞或胚外組織時，該基因則不再表達。原始生殖細胞是原腸胚形成之后唯一表達Oct-4基因的細胞。Oct-4基因在維持ES細胞和原腸胚階段原始生殖細胞全能性表型起著非常重要的作用。我們可以O(shè)ct-4基因的存在與否作為ES細胞鑒定的指標之一。(4)ES細胞的端粒酶活性生殖細胞、胚胎細胞、干細胞和腫瘤細胞具有較高的端粒酶活性。隨著機體組織、細胞的分化，端粒酶活性逐漸降低，所以正常體細胞一般無端粒酶活性。（2）細胞表面標志鑒定

①Oct4基因表達Oct4基因：多能干細胞特異表達的一種發(fā)育多能性的標志基因，是一個轉(zhuǎn)錄因子?？捎肙ct4抗血清和間接免疫熒光法，檢測ES細胞中Oct4基因的表達產(chǎn)物，分化細胞不表達Oct4

，可鑒定胚胎性干細胞是否處于未分化狀態(tài)。Oct4表達特性：8細胞時期，在每個卵裂球中都可檢測到大量Oct4表達產(chǎn)物；囊胚期后，Oct4的表達局限于內(nèi)細胞團細胞，而滋養(yǎng)外胚層和原始內(nèi)胚層均為陰性；到原腸形成后，胚胎內(nèi)唯一能檢測到的Oct4表達的是原始生殖細胞。

②堿性磷酸酶檢測（alkalinephosphatase，AKP）：未分化的ES細胞表面標記AKP呈強陽性，細胞一旦分化，則AKP呈陰性。③胚胎階段特異性細胞表面抗原檢測（stage-specificembryonicantigen，SSEA）：SSEA是一種糖蛋白，在未分化多能干細胞中SSEA為陽性，反之呈陰性。④其他表面標志分子，如TRA-1-60，TRA-1-81，GCTM-a，干細胞因子，生殖細胞核因子等。舉例：胚胎階段特異性細胞表面抗原（SSEA）的檢測

鼠、人ESC表達的表面抗原具有種屬差異性。小鼠：表達早期胚胎特異性抗原SSEA-1,不表達SSEA-3、SSEA-4。

人：表達SSEA-３、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81,不表達SSEA-1。其中SSEA-4一直呈強陽性，SSEA-3為弱陽性,已分化的ESC的SSEA-1表達呈強陽性。人原始生殖嵴細胞（PGC）分離的EGC的SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81均表現(xiàn)為陽性。家兔SSEA-1的表達與小鼠的基本相似，桑椹胚卵裂球和早期囊胚細胞呈陽性，晚期囊胚中部分呈陽性，部分呈弱陽性，少部分呈陰性。因此，常用SSEA-1單克隆抗體來檢測ESC。馬ES細胞的分子標記表達（引自KursadTurksen.《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd），2006）圖A：ES細胞AKP染色陽性B：大部分ES細胞STAT3特異性抗體免疫組化染色陽性

小鼠ES細胞檢測⑤核型的檢測使胚胎干細胞保證正常的核型非常重要，只有具有正常核型的胚胎干細胞才能嵌合到宿主著床前胚胎內(nèi)，共同分化發(fā)育成嵌合體動物；為了進一步鑒定，還可以染色體帶型分析。（3）分化能力檢測體外分化實驗

將所得細胞制成懸液培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中，如所得細胞為ESC，則在培養(yǎng)過程中部分細胞聚集貼壁;培養(yǎng)一段時間后將會分化為神經(jīng)、肌肉、軟骨等不同組織細胞，同時還有部分細胞懸浮生長，先形成簡單類胚體，進一步形成囊狀胚體。根據(jù)ES細胞分化程度不同，可初步了解其分化能力的強弱。體內(nèi)分化實驗以一定量所得細胞腹股溝接種或腹腔注射到同源動物或免疫缺陷小鼠體內(nèi)，若為ESC，經(jīng)過一段時間后，動物注射處可見有組織瘤生成。手術(shù)取瘤，常規(guī)制作切片觀察，可見代表內(nèi)胚層、中胚層和外胚層３個胚層的不同組織細胞。體外分化實驗體

內(nèi)

分

化

實

驗（4）嵌合體的形成利用囊胚注射法，應(yīng)用顯微注射儀將ES細胞注射到受體囊胚腔，使其與正常胚胎結(jié)合在一起，再移植到假孕母鼠子宮腔（胚胎移植），使之發(fā)育成個體。如果ES細胞具嵌合能力，則會融合到宿主胚胎細胞中，并共同分化發(fā)育成各種組織細胞，并產(chǎn)生嵌合體小鼠，嵌合體動物可以通過皮毛顏色、蛋白質(zhì)、DNA指紋、同工酶等進行檢測。而ES細胞一旦分化即喪失全能性，便難以參與胚胎發(fā)育形成嵌合體。NTESTetra-cloneDifferentiationDonor

3.8

ES/EG細胞體外誘導分化3.8.1ES/EG細胞維持未分化的分子機制(1)維持ES細胞未分化關(guān)鍵因子LIF/STAT3通路(signaltransducersandactivatorsoftranscrption):

通過復(fù)合物gp130磷酸化效應(yīng)分子的酪氨酸殘基，將信息傳至細胞核內(nèi)相應(yīng)的靶基因上，而使細胞處于高度增殖狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子Oct-4/3：可使ES細胞維持未分化狀態(tài)。（2）LIF/STAT3通路LIF是通過與細胞表面的受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學效應(yīng)。LIF受體(LIFR)廣泛分布在體細胞上，是一種分子量為250KDa的糖蛋白，LIF與其受體結(jié)合后，可激活結(jié)合于gp130胞內(nèi)近膜部分的JKA激酶，活化的JKA激酶催化gp130胞漿區(qū)的酪氨酸磷酸化，進而激活轉(zhuǎn)錄因子STAT，活化的STAT形成同源二聚體并移向核內(nèi)，與核內(nèi)特異的靶細胞基因位點結(jié)合,并激活STAT1與STAT3，STAT3是維持ES細胞不分化狀態(tài)的決定性因子，被激活后就足以抑制ES細胞的分化。（3）Oct-4Oct-4基因表達上調(diào)2倍可使ES細胞分化為原始內(nèi)胚層細胞；表達程度不變可維持ES細胞未分化狀態(tài)；表達下調(diào)可使ES細胞分化為滋養(yǎng)層細胞。在ES細胞發(fā)生自發(fā)分化的過程中，仍有一定水平的Oct-4表達。說明Oct-4基因的表達是維持ES細胞未分化狀態(tài)的必要條件，但不是充分條件，還需LIF等其它因子的協(xié)同作用。通過對這些信號途徑的研究，發(fā)現(xiàn)只有這些因子處于一種特定的平衡狀態(tài)時，ES細胞才會保持一種未分化的自我更新狀態(tài)，一旦平衡移動了，ES細胞就會開始分化。

干細胞在體外培養(yǎng)需要抑制其分化，目前在體外維持胚胎性干細胞自我更新手段：（1）使用飼養(yǎng)層細胞（STO、MEF）。（2）條件培養(yǎng)基（對數(shù)生長期細胞分泌到培養(yǎng)基中的物質(zhì)，如生長因子中的LIF、白介素-6、制瘤素M、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子等）。（3）直接加入抑制分化的細胞因子，如白血病抑制因子等。3.8.2ES細胞體外分化的基本原理分化模式：自發(fā)分化誘導分化基因調(diào)控分化（1）自發(fā)分化是指ES/EG細胞在體外呈單細胞懸浮培養(yǎng)時，會形成由多種類型細胞組合的類胚體，在加入生長因子干預(yù)后能夠增加某一類型細胞的相對數(shù)量。如形成有搏動功能的心肌細胞，這些細胞具有胎兒心肌細胞的特性。（2）誘導分化途徑：共培養(yǎng)：將ES細胞與不同類型的細胞共同培養(yǎng)。添加分化誘導因子：視黃酸(retinoicacid，RA)、DMSO、3-甲氧苯丙胺、神經(jīng)生長因子等。例如：骨髓基質(zhì)細胞或OP9細胞可誘導ES細胞向造血干細胞分化；PA6細胞可促進ES細胞向神經(jīng)細胞分化；DMSO和丁酸鈉可依次誘導ES細胞形成肝細胞。（3）基因調(diào)控分化基因調(diào)控分化——強化或抑制某些基因表達，形成單一譜系所特有的基因表達方式，定向誘導ES細胞的分化。例如：將TATPDX1融合蛋白轉(zhuǎn)入hES細胞，激活下游靶基因的表達，可促進干細胞胰島素分泌，有助于干細胞向胰島細胞的分化。3.8.3體外誘導分化的方法基因外誘導（epigeneticmanipulation）基因修飾（geneticmethods）（1）基因外誘導誘導劑法序貫誘導法特殊誘導法

a.誘導劑法誘導劑—視黃酸（RA），常用于誘導神經(jīng)細胞分化。誘導機制—通過ES細胞結(jié)合于RA受體，受體與目的基因的DNA結(jié)合域結(jié)合，激活神經(jīng)相關(guān)基因，從而促進神經(jīng)的分化。b、序貫誘導法

序貫誘導法——模仿體內(nèi)胚胎細胞生長和分化的環(huán)境，按ES細胞生長階段，逐步改變培養(yǎng)液成分及血清濃度，添加生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等，誘導ES細胞向神經(jīng)細胞定向分化。“五步序貫誘導法”第一步：擴增未分化的胚胎干細胞；第二步：去除促有絲分裂素或分化抑制劑，懸浮生長，逐漸形成類似體內(nèi)發(fā)育的胚體EBs；第三步：去除生長因子，選擇巢蛋白(nestin)陽性細胞；第四步：使用神經(jīng)細胞培養(yǎng)液，添加生長激素、神經(jīng)營養(yǎng)因子，擴增神經(jīng)前體細胞；第五步：利用促神經(jīng)元存活因子(SPF)誘導，并維持神經(jīng)元成熟。體外誘導分化14d的criptoES細胞,用antiⅢ-tubulin抗體免疫熒光染色分析顯示ES細胞分化成神經(jīng)細胞（引自KursadTurksen.《EmbryonicStemCellProtocols》(2nd)，2006）c、直接分化法將ES細胞在飼養(yǎng)層細胞上高密度延長培養(yǎng)；用神經(jīng)細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，ES細胞自發(fā)分化為神經(jīng)樣細胞；使用無血清神經(jīng)細胞培養(yǎng)液讓ES細胞過度生長；在細胞集落中央可獲得高純度的原始神經(jīng)上皮，進而得到大量神經(jīng)細胞。分化機制：可能是通過神經(jīng)分化內(nèi)定模式(Defau