淺論家族性肌萎縮側索硬化癥研究中pGBKT7

淺論家族性肌萎縮側索硬化癥研究中pGBKT7【摘要】目的構建能在酵母菌AH109中表達的mSOD1cDNA的穿梭表達質粒pGBKT7-mSOD1cDNA,研究突變SOD1編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用。方法通過PCR法以真核表達載pEGFP-mSOD1cDNA為模板，擴增獲得了120bp的mSOD1基因的末端及DNA結合域的片段，經過SalⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，基因重組的方法定向亞克隆于酵母雙雜交載體pGBKT7中，構建形成pGBKT7-mSOD1真核表達載體。結果經轉化，提取質粒雙酶切，核苷酸測序，BALST比對鑒定表明構建成功。結論成功構建穿梭質粒pGBKT7-mSOD1cDNA，為深入研究突變的SOD1基因編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用奠定了基礎。

【關鍵詞】酵母雙雜交載體亞克隆mSOD1cDNApGBKT7

Abstract:ObjectiveToConstructofpGBKT7mSOD1YeastTwoHybridExpressionVectorinstudyoffamilialamyotrophiclateralsclerosisandtostudyProteinproteininteractionsofmutationSOD1encodeprotein.MethodsWegotthemSOD1fragmentfrompEGFPmSOD1bypolymercasereaction(PCR).AfterdigestionbySalⅠandEcoRⅠ,mSOD1fragmentwassubcolonedintoYeastTwoHybirdexpressionvectorpGBKT7.ResultsAtlast,pGBKT7mSOD1YeastTwoHybridexpressionvectorwasconstructedandconfirmedbyRedigestion.ConclusionTheconstructionofpGBKT7mSOD1ishelpfultothestudyingofProteinproteininteractions.

Keywords:YeastTwoHybird;expressionVector;subclone;mSOD1CcDNA;pGBKT7

根據超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)含金屬的不同，可將其分為3種，分別為Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD，哺乳類動物體內，僅含有Cu,Zn-SOD與Mn-SOD。分布在胞漿中Cu,Zn-SOD，稱為SOD1；分布于線粒體中Mn-SOD，稱為SOD2；分布于胞外Cu,Zn-SOD稱為SOD3,其中SOD1是細胞中高水平表達的SOD，是SOD的主要形式［1］。研究小組在對一個肌萎縮側索硬化癥家系致病基因的研究中發(fā)現(xiàn)［2］，SOD1第二號外顯子出現(xiàn)突變，測序分析證實第2號外顯子編碼區(qū)插入了一個堿基A，第2外顯子的插入突變導致SOD1轉錄和翻譯時閱讀框改變，結果SOD1翻譯提前終止，研究小組把這108個堿基對的cDNA暫命名為mSOD1cDNA,提交GenBank，獲得的編號是EF143990。本文報告載體pGBKT7-mSOD1cDNA構建，為研究mSOD1基因突變編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用奠定了基礎。

1材料與方法

材料

主要試劑：限制性內切酶SalⅠ、EcoRⅠ、Taq聚合酶購自大連Takara公司。DNA連接試劑盒購自美國MBI公司，卡那霉素購自上海華美公司，質粒抽提試劑盒購自美國Promega公司。

菌株和質粒：pGBKT7購自美國BDClontech公司，pEGFP-mSOD1為本課題組提供，大腸桿菌DH5α為燒傷研究所提供。根據mSOD1cDNA的序列設計引物：pGBKT7-mSOD1-EcoRIsense5‘-gacGAATTCATGGCGACGAAG-3‘,pGBKT7-mSOD1-SalIantisense:5‘-gacGTCGACATGCTTCCC

CACACCTTCATCT-3‘，引物由上海生工生物科技有限公司合成。

儀器設備：臺式離心機(上海安亭科儀廠生產)，PCR儀(美國Bio-Rad公司生產)，電泳儀(美國Bio-Rad公司生產)，手提紫外燈(美國Upland公司生產)，凝膠成像儀系統(tǒng)GelDoc2000(美國Bio-Rad公司生產)

方法

PCR反應：以pEGFP-mSOD1cDNA為模板，無核酸酶去離子水μL，10×PCRbuffer(mg2+free)5μL,dNTP()4μL,Mgcl2(25mM)3μL,上游引物μL，下游引物μL,模板1μL,Taq酶(5u/μL)μL,總反應體系50μL。擴增條件：94℃預變性5min，緊跟30個循環(huán)，每一個循環(huán)94℃變性30s,55℃復性30s，72℃延伸30s,最后72℃延伸10min補齊末端。

PCR產物電泳及低熔點瓊脂糖凝膠回收和純化：取PCR反應物5μL經%瓊脂糖凝膠電泳，結果擴增出一條約120bp的片段。取余下的PCR產物45μL行%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化120bp的mSOD1cDNA片段，再次5μL經%瓊脂糖凝膠電泳，并測序。

mSOD1酵母雙雜交表達載體pGBKT7-mSOD1cDNA構建：分別以EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pGBKT7和mSOD1回收純化酶切片段及線性化載體，在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產物轉化感受態(tài)細胞α,將pGBKT7-mSOD1cDNA轉化的細胞接種于卡那霉素選擇培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16h，挑出陽性菌落搖菌，采用小質粒提取試劑盒提取質粒，以EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定。

載體pGBKT7-mSOD1cDNA測序和BLAST比對。

2結果

mSOD1cDNA片段的擴增以含有mSOD1cDNA片段的真核表達載體pEGFP-mSOD1為模板，擴增mSOD1cDNA片段，長度120bp，如圖1所示。圖2為膠回收驗證回收效果，從電泳圖看膠回收效果滿意。

mSOD1PCR產物測序結果

mSOD1PCR產物測序的序列結果：

GAATTCatggcgacgaaggccgtgtgcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggcat

catcaatttcgagcagaaggaaagtaatggaccagatgaaggtgtggggaagcatGTCGAC

mSOD1PCR產物測序的序列(圖3，見封2)

測序圖各峰整齊，無重疊，該PCR產物測序結果滿意和可信。

mSOD1cDNA酵母雙雜交載體的亞克隆將經EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切的mSOD1cDNA與線性化的pGBKT7連接，轉化，提質粒，酶切結果如圖4、5。將構建的載體命名為pGBKT7-mSOD1cDNA。

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序和BLAST比對結果

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序序列結果：

CGAGCCGCCATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGG

AGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCGAC

GAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAG

GGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAG

ATGAAGGTGTGGGGAAGCATGTCGACCTGCAGCGGCCGCA

TAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGA

GGGGTTTTTTGCGCGCTTGCAGCCAA

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序結果圖譜：(圖6，見封2)

把mSOD1cDNA構建到載體pGBKT7上，測序圖峰值整齊，無重疊。

BLAST比對結果

經過BLAST比對mSOD1cDNA完全與pGBKT7相連。

3討論

酵母雙雜交技術是20世紀90年代興起的一種研究蛋白質-蛋白質相互作用的高新分子生物學技術［3］，依據真核轉錄因子的DNA域和活性域分離的特性將兩者分離，即將酵母的轉錄因子GAL4分為GAL4BD和GAL4AD。將擬研究的靶蛋自(prey)和釣餌蛋自(bait)分別與GAL4AD、GAL4BD結合形成融合蛋白，只有當靶蛋白與誘餌蛋白相互作用時，GAL4調控的報告基因才能表達，酵母才能在選擇性培養(yǎng)基中生長。該技術不僅用于驗證己知蛋白之間的相互作用,亦可以自酵母雙雜交庫中尋找與誘餌蛋白相結合的新的蛋白質，發(fā)現(xiàn)新基因。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一種金屬酶，它可以使超氧陰離子O2-歧化為過氧化氫和分子氧，故在維持生物體內氧自由基的平衡方面起重要作用。研究表明,基于其細胞定位，認為SOD1主要參與防御外周質及來自外界環(huán)境中的超氧化物對機體的毒害［4-5］。

肌萎縮側索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一種以腦和脊髓中大的運動神經元變性為特征的神經系統(tǒng)變性疾病，5%～10%的患者有家族性。臨床表現(xiàn)為緩慢起病，進行性發(fā)展，逐漸出現(xiàn)四肢肌肉的無力、萎縮，伴錐體束征等。臨床治療非常困難。目前己肯定編碼銅、鋅超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxidedismutase，Cu/ZnSOD)的SOD1基因突變可引起部分家族性ALS的發(fā)?。?］。SOD1基因突變類型多達100種以上［7］。為了進一步研究該家系的發(fā)病機理，本文利用PCR技術和分子克隆方法，把mSOD1cDNA的序列亞克隆到酵母雙雜交的表達載體pGBKT7中，目的是為下一步酵母雙雜交打下基礎，也是深入研究突變的SOD1編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用的關鍵步驟之一。

【參考文獻】

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