生物化學(xué)課件：第四章 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

第五節(jié)蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)五.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)一、膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的分子量1萬~100萬之間，其分子直徑1~100nm之間，在膠體顆粒的范圍。所以蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運(yùn)動(dòng)、光散射、電泳、不能透過半透膜及具有吸附能力等。二、兩性解離及等電點(diǎn)

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）：當(dāng)某蛋白質(zhì)在一定的pH的溶液中，所帶的正負(fù)電荷相等，它在電場中既不向z正極也不向負(fù)極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值叫做該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)與溶液的pH有關(guān)。五.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

pH<pI

正電荷

pH>pI

負(fù)電荷

pH=pI

靜電荷為零二、兩性解離及等電點(diǎn)

五.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)受到某些理化因素的影響，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能隨之改變或喪失，但未導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的改變，這種現(xiàn)象叫變性作用（denaturation）。1、蛋白質(zhì)變性的概念2、蛋白質(zhì)變性的因素物理因素：加熱、紫外線、超聲波、高壓等；化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、脲、鹽酸胍、去垢劑、重金屬鹽等；三、蛋白質(zhì)的變性五.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)變性蛋白質(zhì)通常都是固體狀態(tài)物質(zhì)，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復(fù)原有蛋白質(zhì)所具有的性質(zhì)。所以，蛋白質(zhì)的變性通常都伴隨著不可逆沉淀三、蛋白質(zhì)的變性生物活性喪失（酶）；溶解度降低，粘度增大，擴(kuò)散系數(shù)變?。ǖ扒澹?；基團(tuán)位置改變；對蛋白酶敏感性增大。3、蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)五.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)三、蛋白質(zhì)的變性4、蛋白的復(fù)性

蛋白質(zhì)的變性作用若不過于劇烈，則是一種可逆過程。高級結(jié)構(gòu)松散了的變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊形成原來的構(gòu)象，恢復(fù)原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象稱為復(fù)性(renaturation)。

大多蛋白質(zhì)變性后，很難復(fù)性。五.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀加入適當(dāng)?shù)脑噭┦沟鞍踪|(zhì)分子處于等電點(diǎn)狀態(tài)或失去水化層，蛋白質(zhì)的膠體溶液就不在穩(wěn)定并將產(chǎn)生沉淀。能使蛋白質(zhì)沉淀的試劑有：1）高濃度中性鹽（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白質(zhì)的電荷）這種加入鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析，用于蛋白質(zhì)分離制備。2）有機(jī)溶劑

丙酮、乙醇(破壞蛋白質(zhì)水膜)五.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)四、蛋白質(zhì)的沉淀3）重金屬鹽

Hg2+、Ag+、Pb+

（與蛋白質(zhì)中帶負(fù)電基團(tuán)形成不易溶解的鹽）4）生物堿試劑苦味酸、三氯乙酸、目酸、鎢酸等（與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團(tuán)生成不溶性鹽）五.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離純化

按照蛋白質(zhì)分子大小進(jìn)行，能否分離取決于透析袋截留的分子量。六.蛋白質(zhì)的分離和純化1、透析(dialysis)和超濾(ultra-filtration)

透析：

透析液濃縮的蛋白樣品

透析袋

開始透析處于平衡狀態(tài)六.蛋白質(zhì)的分離和純化1、透析(dialysis)和超濾(ultra-filtration)

攪拌式超濾器可配備不同截留分子量的超濾膜使用，在高流速操作中對高達(dá)10%大溶質(zhì)濃度的樣品進(jìn)行快速濃縮或脫鹽，濃縮倍數(shù)可達(dá)100倍，獨(dú)特的磁力攪拌設(shè)計(jì)可避免濃縮過程中的蛋白樣品在膜表面形成的蛋白凝膠極化，從而加快工作速度，提高濃縮倍數(shù)。實(shí)驗(yàn)室用超濾器超濾2、鹽析（saltingout）基本原理：不同蛋白質(zhì)的不同溶解度作用機(jī)理：中性鹽中和表面電荷，破壞水化層常用方法：分級沉淀法操作方法：固體加入法飽和溶液加入法六.蛋白質(zhì)的分離和純化

3、電泳(electrophoresis)：（1）帶電顆粒在電場作用下向其電荷相反方向移動(dòng)的現(xiàn)象（2）主要分成兩大類：自由界面電泳

區(qū)帶電泳紙、薄膜電泳3、電泳(electrophoresis)SDS在蛋白質(zhì)溶解液中加入SDS和疏基乙醇。巰基乙醇使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，使多肽分成亞基SDS使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變，并形成近似長橢圓棒復(fù)合物。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸相同，約1.8nm，而長軸則與蛋白質(zhì)的Mr成正比。2023/10/9南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院222023/10/9南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院23等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)，凈電荷為零，在電場中不再移動(dòng)。5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度pH3pH10IEFSDS雙向電泳示意圖4、層析

(chromatography)

根據(jù)的蛋白質(zhì)性質(zhì)（1）凝膠層析（過濾）：分子量與分子形狀特性（2）離子交換層析：電荷特性（3）親和層析：生物學(xué)特性

凝膠層析（GelChromatography）名稱又稱凝膠過濾（GelFiltration）

分子篩過濾（層析）二凝膠種類1葡聚糖凝膠（如SephadexG-100）2聚丙烯酰胺凝膠如Bio-GelP-2003瓊脂糖凝膠如Sephrose4B蠕動(dòng)泵層析柱緩沖液儲存器自動(dòng)部分收集儀紫外檢測儀記錄儀層析方向

凝膠過濾層析原理凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠離子交換層析（IonexchangeChromatography）

基本概念1什么是離子交換層析？

是以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相，通常是先設(shè)法讓樣液中的離子與離子交換劑上的解離基團(tuán)進(jìn)行交換而被固定在離子交換劑上，然后再通過提高溶液中相反離子濃度或者降低蛋白質(zhì)所帶電荷數(shù)的方法將所要蛋白質(zhì)分離出來的一種層析法。離子交換劑（1）基本構(gòu)成：基質(zhì)功能基團(tuán)反離子（2）需要滿足的要求高度的不溶解性有疏松的多孔結(jié)構(gòu)或有巨大的表面積有較多的交換基團(tuán)有穩(wěn)定的理化性質(zhì)常用和重要的有：a羧甲基纖維素（CM-C）

陽離子交換劑

纖維素上交聯(lián)了-O-CH2-COO-

b二乙基氨基乙基纖維素（DEAE-C）

陰離子交換劑

纖維素上交聯(lián)了--O-（CH2）2-NH+-（C2H5）2還有交聯(lián)葡聚糖離子交換劑交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑等蠕動(dòng)泵層析柱梯度混合儀自動(dòng)部分收集儀紫外檢測儀記錄儀層析方向

基本設(shè)備裝置與凝膠層析相似二

基本原理5、離心（centrifugation）（1）實(shí)驗(yàn)室常用離心機(jī)類型

普通離心機(jī)

一般不帶冷凍設(shè)備分地面式（3000-6000rpm）和臺式（3000-16000rpm）

高速冷凍離心機(jī)有制冷設(shè)備臺式與地面式，18000-25000rpm，0-4℃。超速離心機(jī)有制冷設(shè)備和真空設(shè)備只有地面式，達(dá)30000rpm，0-4℃。

相對離心力相對于地球引力的離心力

F（通常指單位離心力）

RCF=——=1.119x10-5rn2

（g）

mg

密度梯度（區(qū)帶）離心

(densitygradient

ultracentrifugation)根據(jù)性質(zhì)：分子大小、形狀

蛋白質(zhì)分子在具有密度梯度的介質(zhì)中離心，質(zhì)量與密度大的蛋白質(zhì)分子比質(zhì)量與密度小的沉降速度快，最后每種蛋白質(zhì)分子會停留在與其自身密度相等的介質(zhì)中形成區(qū)帶。蛋白質(zhì)含量測定和純度鑒定（1）蛋白質(zhì)含量測定在實(shí)驗(yàn)課中學(xué)習(xí)

微量凱氏定氮法