紫杉醇與人血清白蛋白的毛細(xì)管區(qū)帶電泳研究

紫杉醇與人血清白蛋白的毛細(xì)管區(qū)帶電泳研究

藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合研究對藥物動力學(xué)和療效研究起到了非常重要的領(lǐng)導(dǎo)作用。紫杉醇被譽為20世紀(jì)90年代抗腫瘤藥三大成就之一,對鉑耐藥的卵巢癌療效較好。作為應(yīng)用于臨床的新型藥物,它既是婦科卵巢癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的一線用藥,也是腫瘤晚期仍行之有效的化療藥物,因此研究紫杉醇與人血清蛋白的結(jié)合作用機制具有很重要的意義。已報道的研究紫杉醇和HSA相互結(jié)合的方法有可見分光光度法,熒光法、抗原沉淀法,傅立葉紅外光譜、凝膠電泳等,但這幾種方法都不同程度的存在耗樣量較大,成本高,操作復(fù)雜等缺點。本文用毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)研究了紫杉醇與人血清蛋白結(jié)合的相互作用,得到的結(jié)合常數(shù)和文獻(xiàn)報道的相一致。1實驗部分1.1儀器、儀器和儀器P/ACEsystem5000毛細(xì)管電泳儀(美國Beckman公司),內(nèi)設(shè)恒溫系統(tǒng)和紫外檢測器,未涂層熔硅彈性石英毛細(xì)管柱47cm×50μmi.d.,有效長度40cm(河北永年光纖廠);TDA-8002型恒溫水浴箱(河北黃驊市航天儀器廠);TU-1901型紫外分光光度計(北京Purkinje儀器總廠);970CRT熒光分光光度計(上海分析儀器總廠);ALC-210.4型電子天平;PHS-3C型pH計(上海雷磁儀器廠)。數(shù)據(jù)采集和圖譜處理由儀器自帶的軟件P/ACEstationversion1.21完成。1.2紫杉醇貯備液紫杉醇(Paclitaxel)(純度97%～99%,中國藥品生物制品檢定所);人血清蛋白(HSA)(SigmaNO.37820美國);K2HPO4,KH2PO4,NaCl和無水乙醇均為分析純;水為二次蒸餾水。紫杉醇貯備液用無水乙醇配制,濃度為1.0mg/mL;人血清蛋白儲備液用磷酸鹽緩沖液定容至83μmol/L。貯備液均保存于4℃冰箱,實驗時根據(jù)需要逐級稀釋。1.3實驗操作1.3.1反應(yīng)時間和背景緩沖溶液沖洗按要求配制實驗所需各種緩沖溶液,用0.45μm的微孔濾膜過濾,并經(jīng)超聲脫氣處理。進(jìn)樣前毛細(xì)管分別用0.10mol/LHCl溶液,水,0.10mol/LNaOH溶液和水各沖洗2.0min,再用背景緩沖溶液沖洗2.0min。分離模式為毛細(xì)管區(qū)帶電泳,緩沖溶液為50mmol/L硼砂-碳酸鈉(pH=10),進(jìn)樣方式為氣動進(jìn)樣,壓力(0.50psi),進(jìn)樣5.0s,分離電壓21kV,紫外檢測波長為214nm,毛細(xì)管柱溫為20℃。1.3.2mol/l模型用磷酸鹽緩沖液分別稀釋紫杉醇和人血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液至1.0μmol/L。蛋白液和紫杉醇以不同比例混合用磷酸鹽緩沖液定容于1.0mL的微量器中,放入恒溫箱中溫度分別控制在298和310K,在上述電泳條件下測定紫杉醇的游離濃度。2結(jié)果與討論2.1實驗條件的優(yōu)化2.1.1不同緩沖液的分離固定樣品濃度和電壓(17kV),緩沖溶液濃度為50mmol/L,進(jìn)樣時間10s,分別考察了7種緩沖體系下的樣品峰高。實驗表明通常使用的Tris-HCl(pH9.0),NaH2PO4-Na2HPO4(pH7.0)和Na2B4O7-HCl(pH8.5)3種緩沖液無法分離檢測,NaH2PO4-Na2B4O7(pH8.0),NaHCO3-Na2B4O7(pH9.0),NaHCO3-Na2CO3(pH10.0),Na2B4O7-Na2CO3(pH9.2)4種緩沖液雖然可以分離但是前3種信號較低,且峰展寬,故選Na2B4O7-Na2CO3(pH9.2)為運行緩沖液。2.1.2溶液對峰高的影響固定pH為9.2,電壓17kV,進(jìn)樣時間10s,考察不同濃度緩沖溶液對峰高的影響。結(jié)果表明:隨著緩沖溶液濃度的增加,樣品峰高隨之逐漸增高,但緩沖溶液濃度過大會導(dǎo)致電流過高焦耳熱也急劇增大,峰高隨之降低,遷移時間增大,不利于分離測定。于是選50mmol/L為最佳緩沖溶液濃度。2.1.3進(jìn)樣時間和進(jìn)樣時間固定樣品濃度和電壓(17kV),緩沖溶液濃度50mmol/L,進(jìn)樣時間10s。以碳酸鈉-硼砂緩沖體系測定不同pH條件下樣品的峰高,實驗表明pH增加時信號增加,但是當(dāng)pH>10時基線不穩(wěn)且有拖尾現(xiàn)象,因此應(yīng)選pH10為最佳背景緩沖溶液pH。2.1.4分離電壓對峰高的影響固定pH為10,緩沖溶液濃度50mmol/L,進(jìn)樣時間10s,考察分離電壓對峰高的影響。實驗表明:隨著分離電壓的增加,樣品峰高隨之增高,但電壓過大也會導(dǎo)致電流過高,使峰高隨之降低,而遷移時間是隨電壓的升高逐漸減小的,綜合考慮峰高和遷移時間,選擇分離電壓為21kV。2.1.5進(jìn)樣時間的選擇由于電動進(jìn)樣的歧視效應(yīng)會導(dǎo)致分離度較差,所以選擇氣動進(jìn)樣。結(jié)果表明,進(jìn)樣時間較短時,峰高和進(jìn)樣時間基本呈線性,但信號太小,靈敏度低,而進(jìn)樣時間過長,樣品塞的增長導(dǎo)致峰展寬,峰高降低,遷移時間提前,分離度變差,于是選進(jìn)樣時間為5.0s,既能保證靈敏度的要求,又能獲得良好的分離效果。pH10,50mmol/L硼砂-碳酸鈉為緩沖溶液,運行電壓21kV,進(jìn)樣時間5.0s,紫杉醇與HSA達(dá)到結(jié)合平衡后的毛細(xì)管電泳圖如圖1。2.2紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)液的制備分別準(zhǔn)確配制5.1×10-7、1.3×10-6、5.1×10-6、1.3×10-5、5.1×10-5、1.3×10-4g/mL的紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)液且在上述優(yōu)化的條件下分離檢測。以峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,在1.3×10-6～5.1×10-5g/mL間線性良好,線性方程為Y=2123+3.025ρ(10-6g/mL)(r=0.9949,n=5)。2.3多酚結(jié)合反應(yīng)2.3.1結(jié)合反應(yīng)平衡時間對紫杉醇和人血清蛋白結(jié)合反應(yīng)在298和310K的條件下考察結(jié)合反應(yīng)平衡時間。實驗結(jié)果表明結(jié)合反應(yīng)在兩種不同溫度下40min均達(dá)到平衡,增加反應(yīng)時間峰高無顯著變化。2.3.2藥物與hsa的相互作用分別取5只1mL微量器,先加入100μL1μmol/L的HSA,然后分別加入同濃度的紫杉醇20、50、100、150、200、250μL,用磷酸鹽緩沖液定容后搖勻,分別先后放在298和310K的恒溫水浴箱,放置40min,使其達(dá)到平衡。由于毛細(xì)管電泳可以分離蛋白質(zhì),所以樣品無需前處理,可直接進(jìn)樣。藥物與血清蛋白之間存在非共價作用力,一般采用位點結(jié)合模型,即Scatchard方程式:ν=[Pt]?[P][At]ν[P]=nK?νKν=[Ρt]-[Ρ][At]ν[Ρ]=nΚ-νΚ式中[Pt]和[At]分別表示為體系中藥物和人血清蛋白的總濃度,[P]表示游離藥物的濃度,ν表示平均結(jié)合數(shù),n表示結(jié)合位點數(shù),K表示結(jié)合常數(shù)。固定HSA的濃度[At],改變藥物分子總濃度[Pt],求不同藥物分子總濃度時的ν值,表1列出了該實驗中利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳和紫外檢測相結(jié)合測得的不同摩爾比的藥物與HSA的相互作用數(shù)據(jù)。以ν[P]ν[Ρ]對ν作圖可得一直線如如圖2所示。310K時:ν[P]=?3.226V+10.14(R=0.9911,N=6)ν[Ρ]=-3.226V+10.14(R=0.9911,Ν=6);298K時:ν[P]=?1.606V+6.928(R=0.9926?N=6)ν[Ρ]=-1.606V+6.928(R=0.9926?Ν=6)。根據(jù)Scatchard方程式,可以得到K=3.4×104L/mol,n=3.0(310K)和K=1.7×104L/mol,n=4.1(298K)。由不同溫度下的平衡常數(shù)根據(jù)熱力學(xué)公式可得ΔG、ΔH和ΔS分別為-27kJ,45kJ/mol,233J·mol-1·K-1(310K)及-24kJ,45kJ/mol,233J·mol-1·K-1(298K),表明其作用過程是一個熵增加,吉布斯自由能降低的自發(fā)分子作用過程。2.3.3混合溶液的吸收光譜測量固定人血清蛋白溶液濃度不變,不斷增加紫杉醇的濃度,以紫杉醇空白液為參比,測量混合溶液的吸收光譜。以吸光度A為縱坐標(biāo),繪制吸收曲線?？梢钥闯?隨著紫杉醇濃度的增加,紫杉醇各吸收帶均有規(guī)律的增大,但是并沒有出現(xiàn)一等吸收帶,這表明紫杉醇與人血清蛋白之間存在著范德華力結(jié)合特征,見圖3。2.3.4紫杉醇濃度對hsa表達(dá)的影響利用熒光分光光度計可測得紫杉醇-HSA體系的熒光發(fā)射光譜圖,可以看出隨著紫杉醇濃度的增加,HSA的內(nèi)源熒光強度有規(guī)律的降低。這也說明兩者之間存在著相互作用,并對HSA的內(nèi)源熒光起靜態(tài)熄滅作用(見圖4)