柱相色譜法分離酮康唑的研究

柱相色譜法分離酮康唑的研究

身體蛋白質(zhì)的組成包括氨基酸、糖和其他代謝過程中的酶、受體和載體。當(dāng)外包藥物進入生物體時，它們的反應(yīng)方法與不同的分子識別反應(yīng)相同。因此，這兩種藥物通常具有不同的藥理作用，它們的代謝路徑和受體選擇也不同。換句話說，存在三維選擇性。目前,臨床上常用的2000余種化學(xué)藥物中,手性藥物約占40%,單一對映體藥物不足100種;大多數(shù)藥物以外消旋體形式供藥用,因此研究高分離效能、高靈敏度的手性藥物拆分和測定方法對提高藥效和控制藥物質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實意義。酮康唑(ketoconazole,KTZ)是一種廣譜抗真菌口服藥物,盡管酮康唑有兩個手性中心,但這兩個手性中心上的氫原子和2,4-二氯苯基都在二氧戊環(huán)的同側(cè),存在較大的空間位阻,因而酮康唑只有一對對映體,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。研究表明,它的兩個對映體具有不同的藥理活性,左旋酮康唑比右旋酮康唑的藥理活性高2～4倍。目前臨床上以外消旋體供藥,因此研究酮康唑的手性拆分方法對研究其藥理和藥效作用都具有重要的意義。Castro-Puyana等和Crego等用毛細(xì)管電泳技術(shù)對酮康唑進行了手性拆分,流動相中含0.1mol/L磷酸鹽(pH3.3)、20.0mmol/L七(2,3,6-三-O-甲基)-β-CD,前者在11min內(nèi)兩個對映體達到基線分離,分離度為6.0;后者在7min內(nèi)兩個對映體達到基線分離,分離度為5.2。Toribio等用超臨界流體色譜法,以CO2作為流動相,分別用ChiralpakAD手性柱(多糖的羥基被3,5-二甲基苯基氨基甲酸鹽取代后作為手性固定相)和ChiralcelOD手性柱(纖維素的羥基被3,5-二甲基苯基氨基甲酸鹽取代后作為手性固定相)成功分離了酮康唑?qū)τ丑w。Bernal等分別用ChiralpakAD手性柱和ChiralcelOD手性柱對酮康唑進行了拆分,流動相組成為醇類(甲醇、乙醇或2-丙醇)和水,保留時間都超過60min。但未見采用手性流動相添加法拆分酮康唑?qū)τ丑w的報道。本文采用反相C18鍵合固定相,在流動相中添加手性選擇劑,實現(xiàn)了酮康唑?qū)τ丑w的拆分,并對影響酮康唑手性拆分的主要因素(如環(huán)糊精的種類和濃度、流動相pH值、柱溫以及甲醇和磷酸鹽溶液的體積比等)進行了研究。結(jié)果表明,采用磺丁基-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD)作為手性流動相添加劑,可以成功地拆分酮康唑外消旋體,分離效果好,方法簡便,對于酮康唑手性拆分具有應(yīng)用價值。1實驗部分1.1精密旋光儀測定LC-10ADvp高效液相色譜儀(日本島津公司);TL-9900色譜工作站;FA1104N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司);pHs-2C型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠);WZZ-2B自動旋光儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。酮康唑外消旋體(西安楊森制藥公司提供);SBE-β-CD、磺丁基-羥丙基-β-環(huán)糊精(SBE-HP-β-CD)、羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)(南京師范大學(xué)江蘇省醫(yī)藥超分子材料及應(yīng)用重點實驗室提供);β-CD(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);磷酸二氫鈉(化學(xué)純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);濃磷酸(化學(xué)純,南京化學(xué)試劑廠);甲醇(色譜純,山東禹王實業(yè)有限公司);三乙胺(化學(xué)純,上海金山亭新化工試劑廠);實驗用水均為重蒸水。1.2供試品溶液配制的配制:精密稱取酮康唑適量,用甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度約為1.00g/L的貯備液,再用流動相稀釋成5.00mg/L的供試品溶液,在4℃下保存。1.3磺丁基--環(huán)糊精的將酸鈉某品牌色譜柱:DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm,5μm,迪馬公司)。流動相:甲醇-0.02mol/L磷酸二氫鈉(體積比為60∶40,含1.0mmol/L磺丁基-β-環(huán)糊精及0.02%三乙胺,稀磷酸調(diào)節(jié)pH3.00);流速:1.00mL/min;檢測波長:225nm;進樣量:20μL。使用前,流動相經(jīng)0.45μm有機濾膜過濾并超聲脫氣。2結(jié)果與討論2.1手性添加劑的選擇本實驗以SBE-β-CD、β-CD、HP-β-CD、SBE-HP-β-CD作為手性選擇劑,分別考察了它們對酮康唑?qū)τ丑w手性分離的影響。由圖2可見在相同條件下,只有SBE-β-CD可使酮康唑?qū)τ丑w完全分離,而β-CD只能部分拆分酮康唑?qū)τ丑w,HP-β-CD和SBE-HP-β-CD均不能拆分酮康唑?qū)τ丑w。這可能是由于酮康唑的苯環(huán)進入SBE-β-CD的疏水空腔,形成范德華力;酮康唑的氧原子和SBE-β-CD的羥基形成氫鍵;而酮康唑含有哌嗪基顯堿性,在實驗的pH條件下帶正電荷,而磺丁基帶負(fù)電荷,產(chǎn)生靜電作用相互吸引;這3種因素的共同作用使得SBE-β-CD和酮康唑?qū)τ丑w形成了穩(wěn)定程度有異的包結(jié)物,因此成功拆分了酮康唑?qū)τ丑w。β-CD分子像個無底的桶,其中2位和3位上的羥基在空腔的大口端,6位上的羥基在空腔的小口端。2位上的羥基相對于環(huán)糊精空腔是朝外的,對環(huán)糊精的手性選擇幾乎沒有影響;3位上的羥基的方向與環(huán)糊精的軸線幾乎平行,所以3位上的取代基的性質(zhì)對環(huán)糊精的立體選擇性影響最大;6位上的取代基的性質(zhì)主要影響環(huán)糊精分子的形狀,如果在6位上引入極性小、體積大的基團,會使環(huán)糊精分子的小口端變大,而大口端變小。若SBE-HP-β-CD的磺丁基和羥丙基取代發(fā)生在3位的羥基上,則由于空間位阻作用,使酮康唑進入環(huán)糊精的空腔困難,導(dǎo)致手性匹配性差,這可能是其不能很好地拆分酮康唑?qū)τ丑w的原因。而HP-β-CD和β-CD是中性的,不能和酮康唑形成靜電作用,所以拆分效果也不理想。因此實驗選擇SBE-β-CD作為手性添加劑。實驗進一步考察了SBE-β-CD的濃度對酮康唑?qū)τ丑w手性分離的影響。從圖3可見,酮康唑?qū)τ丑w的分離度隨著SBE-β-CD濃度的增加而增大,同時保留時間也增加。這是因為SBE-β-CD濃度的增加增強了其與對映體之間的相互作用,使對映體之間的色譜行為差異擴大,因此提高了分離度。考慮到增加SBE-β-CD的濃度影響色譜柱的使用壽命,同時保留因子也會增大,保留時間延長,柱效降低,所以本文選擇SBE-β-CD的濃度為1.0mmol/L。2.2ph值對sbe--cd分離度的影響在手性拆分過程中,pH值是一個重要參數(shù)。在其他條件不變時,酮康唑?qū)τ丑w在pH值2.70～5.00范圍內(nèi)可以達到基線分離。由表1可見,酮康唑兩個對映體的分離度和保留因子在此范圍內(nèi)均隨著pH值的增加而增大。這可能是因為當(dāng)pH值比較低時,SBE-β-CD2位上的羥基質(zhì)子化,不能和酮康唑的氧原子形成氫鍵,使手性匹配性較差;而當(dāng)pH值增大時,2位上的羥基的質(zhì)子化程度減小,使手性匹配性增加,分離度也相應(yīng)增大。酮康唑是一種弱堿,pH值增加,其電離受到抑制,使分子的極性降低,在反相色譜柱上的保留增強,保留因子相應(yīng)增大。當(dāng)pH>5時,酮康唑?qū)τ丑w在反相色譜柱上的保留時間在1h以上,拆分效率明顯降低。故本文最終選擇pH為3.00。2.3增加甲醇的比例流動相中甲醇的比例對拆分效果的影響很大。由表2可以看出,增加甲醇的比例可以使酮康唑?qū)τ丑w的保留因子減少,同時分離變差。這可能是由于甲醇與酮康唑?qū)τ丑w競爭流動相中的磺丁基-β-環(huán)糊精的疏水空腔,使得分離度減小。2.4色譜條件選擇磺丁基-β-環(huán)糊精和酮康唑?qū)τ丑w分子形成包結(jié)物是一個放熱的過程,因此降低溫度會抑制酮康唑分子的振動和轉(zhuǎn)動,增加包結(jié)物的穩(wěn)定性和分子之間的手性匹配,所以降低溫度對手性拆分有利,結(jié)果見圖4。但是柱溫太低會增加流動相的黏度,使色譜系統(tǒng)柱壓過高。綜合考慮以上因素,最終選擇柱溫為30℃。綜上所述,手性拆分KTZ對映體的最佳的色譜條件如“1.3”節(jié)所述。在優(yōu)化的色譜條件下酮康唑?qū)τ丑w的分離結(jié)果見圖5,由此可見在6min之內(nèi)就可使酮康唑?qū)τ丑w分離,分離度達2.05。2.5酮康唑出峰酮康唑單一對映體的對照品很難獲得,迄今未見對酮康唑?qū)τ丑w進行定性的相關(guān)研究報道。本文分別收集兩個對映體峰的流出液,測定其旋光方向,測得先后兩峰流出液分別呈左旋和右旋,即(-)-2S,4R-酮康唑先于(+)-2R,4S-酮康唑出峰。原因可能為流動相中的磺丁基-β-環(huán)糊精是由7個D(+)吡喃型葡萄糖殘基經(jīng)α-1,4-糖苷鍵結(jié)合并由磺丁基衍生化而形成的,根據(jù)“三點作用”分離理論,當(dāng)它和右旋酮康唑相互作用時,右旋酮康唑的苯環(huán)、氧原子和哌嗪基分別和磺丁基-β-環(huán)糊精的空腔、羥基和磺丁基相互匹配,形成比較穩(wěn)定的包結(jié)物,而左旋酮康唑無論怎樣旋轉(zhuǎn),最多有兩個基團可以和磺丁基-β-環(huán)糊精相應(yīng)的基團相互作用