甲硝唑與牛血清白蛋白作用的對(duì)比研究

甲硝唑與牛血清白蛋白作用的對(duì)比研究

硝基溶膠（met）是當(dāng)前結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)（見圖1）。廣泛使用且廉價(jià)的抗厭氧菌藥物用于抗厭氧菌感染，如腹腔、胃腸道、女性殖器、下呼吸道、皮膚、軟組織、骨骼和關(guān)節(jié)。它也用于抗凝劑和替代物。血清蒼白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)。它可以與許多內(nèi)源性和外源性化合物結(jié)合。藥物研究和血清蒼白是闡明藥物儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程、藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)以及藥理學(xué)研究的價(jià)值。這是當(dāng)今科學(xué)研究、化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的一個(gè)共同興趣和興趣。熒光光譜是研究生物大分子與有機(jī)小分子相互作用的重要手段之一.共振光散射光譜是一種新的分子光譜技術(shù),由于這種技術(shù)在研究生物大分子識(shí)別、組裝和聚集時(shí)呈現(xiàn)出靈敏而豐富的信號(hào),已廣泛用于生物大分子的定量分析.但應(yīng)用共振光散射光譜研究藥物與生物大分子作用機(jī)理未見報(bào)道本文用熒光光譜在模擬人體生理pH值條件下研究甲硝唑與牛血清白蛋白(BSA)之間的相互作用機(jī)理的同時(shí),用共振光散射光譜討論MET與蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)理,發(fā)現(xiàn)兩種光譜得到的不同溫度下MET對(duì)蛋白質(zhì)的猝滅常數(shù)KSV、靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB、表觀結(jié)合常數(shù)KA均在相同的數(shù)量級(jí)范圍內(nèi),MET在蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均近似為1.本文還報(bào)道了MET與BSA間的熱力學(xué)參數(shù)、作用力、作用距離等重要信息及MET對(duì)BSA構(gòu)象的影響,試圖從分子水平了解蛋白質(zhì)分子與小分子間相互作用機(jī)制,為生命科學(xué)研究提供有用的信息.1實(shí)驗(yàn)部分1.1研究對(duì)象RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);PHS-3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠);UV-530型紫外-可見分光光度計(jì)(日本JASCO公司);FC-204電子分析天平(上海天平儀器廠);501型超級(jí)恒溫器(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠).甲硝唑(MET,純品原料藥,由四川樂(lè)山長(zhǎng)征制藥廠提供)工作液:2.60×10-3mol·L-1;牛血清白蛋白(BSA,上海伯奧生物科技有限公司)溶液:5.20×10-5mol·L-1;NaCl溶液:0.5mol·L-1;pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液.除MET、BSA外,其余試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水,經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)熒光雜質(zhì).1.2熒光光譜分析在10mL比色管中依次加入0.5mol·L-1的NaCl溶液2.00mL、BSA溶液2.00mL及一定量的MET工作液,以Tris-HCl緩沖溶液定容為10.0mL用狹縫寬度分別為3nm的RF-5301熒光分光光度計(jì)在激發(fā)和發(fā)射光譜,測(cè)定一定溫度時(shí)BSA及BSA在MET作用下的熒光光譜、同步熒光光譜、共振光散射光譜;用UV-530型紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定MET的紫外吸收光譜.2結(jié)果和討論2.1光譜特征2.1.1met和bsa的熒光發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)檢測(cè)的影響蛋白質(zhì)的熒光猝滅可用于研究藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合信息,當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280nm時(shí),蛋白質(zhì)表現(xiàn)的是色氨酸和酪氨酸殘基的熒光.而激發(fā)波長(zhǎng)為295nm時(shí),僅僅表現(xiàn)色氨酸殘基的熒光.圖2表明了蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨MET濃度的增加而熄滅的過(guò)程.在兩種激發(fā)波長(zhǎng)下.MET在300-450nm范圍內(nèi)并無(wú)熒光,從圖2可見,當(dāng)MET和BSA發(fā)生作用后,BSA的熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生紅移,且發(fā)射波長(zhǎng)紅移的值隨MET濃度的增加而增加,當(dāng)MET和蛋白質(zhì)的摩爾比達(dá)到30.0時(shí),蛋白質(zhì)熒光發(fā)射波長(zhǎng)移動(dòng)了25nm.紅移表明蛋白質(zhì)里的色氨酸殘基被帶到了一個(gè)更親水的環(huán)境.2.1.2met對(duì)bsa共振光散射光譜的影響圖3為MET對(duì)BSA共振光散射光譜的影響由圖3知,隨著MET濃度的增大,其蛋白質(zhì)的共振光散射峰紅移,且發(fā)生共振光散射強(qiáng)度猝滅的現(xiàn)象.2.2甲硝唑?qū)Φ鞍踪|(zhì)的工作特性熒光猝滅通?？煞譃閯?dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅.動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程遵循Stern-Volmer方程:靜態(tài)猝滅過(guò)程遵循Lineweaver-Burk方程:其中cQ是猝滅劑的濃度,Kq為雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù),KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光分子壽命.生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s.F0為無(wú)猝滅劑時(shí)BSA的熒光,F為有猝滅劑時(shí)BSA的熒光.KLB為靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù).在不同溫度下,用MET作猝滅劑,以343nm處的熒光強(qiáng)度作Stern-Volmer曲線和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,見圖4.由圖4可見,當(dāng)藥物和蛋白質(zhì)的摩爾比超過(guò)10.5時(shí),動(dòng)態(tài)猝滅曲線不呈線性關(guān)系,且隨cMET的增加,呈現(xiàn)出向上彎曲的現(xiàn)象.而靜態(tài)猝滅曲線則呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,初步說(shuō)明MET對(duì)蛋白質(zhì)熒光的猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅,為進(jìn)一步證實(shí)其猝滅過(guò)程,對(duì)圖4a的線性部分及圖4b進(jìn)行線性擬合,由直線斜率求得猝滅常數(shù)KSV、雙分子猝滅常數(shù)Kq、靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB,見表1.在動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程中,一般情況下各類猝滅劑對(duì)生物大分子熒光壽命衰減速率影響的Kq值不大于2.00×1010L·mol-1·s-1.因此,甲硝唑?qū)Φ鞍踪|(zhì)的猝滅不是動(dòng)態(tài)猝滅,而是甲硝唑與蛋白質(zhì)結(jié)合引起的靜態(tài)猝滅.藥物與蛋白質(zhì)之間的相互作用一般采用位點(diǎn)結(jié)合模型來(lái)描述,依據(jù)文獻(xiàn)推導(dǎo)出的熒光強(qiáng)度(F)、猝滅劑濃度(cQ)與表觀結(jié)合常數(shù)(KA)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)之間的關(guān)系:以lg(F0-F)/F對(duì)lgcQ作圖,MET為猝滅劑,由直線斜率可得298K時(shí),MET與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.06±0.02(曲線的相關(guān)系數(shù)為r=0.9981),表明1分子的甲硝唑和1分子的蛋白質(zhì)結(jié)合.即甲硝唑與BSA作用時(shí)具有1個(gè)獨(dú)立的結(jié)合部位.由直線截距可計(jì)算出在298K下甲硝唑與蛋白質(zhì)的表觀結(jié)合常數(shù)KA=2.22×104L·mol-1.2.3熒光符合譜分析的初步篩選在蛋白質(zhì)溶液中,隨著甲硝唑濃度的增加,其蛋白質(zhì)的共振光散射強(qiáng)度依次降低,這可能是由于甲硝唑在血清白蛋白表面結(jié)合后,破壞了白蛋白表面的保護(hù)水層,使原來(lái)較為分散的蛋白質(zhì)更加分散,即所謂的解聚作用,引起蛋白質(zhì)粒徑減小,共振散射的截面積減小,導(dǎo)致共振散射強(qiáng)度下降.當(dāng)反應(yīng)體系中共振光散射為蛋白質(zhì)產(chǎn)生時(shí),設(shè)I0為無(wú)猝滅劑時(shí)BSA的散射光強(qiáng)度,I為有猝滅劑時(shí)BSA的散射光強(qiáng)度,以349nm處散射光強(qiáng)度作Stern-Volmer和Lineweaver-Burk曲線,見圖5.并由圖5可求得猝滅常數(shù)KSV和靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB,見表2.將(3)式用于此體系得出在298K時(shí),甲硝唑與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.10±0.06(曲線的相關(guān)系數(shù)r=0.9902),甲硝唑與蛋白質(zhì)的表觀結(jié)合常數(shù)KA=3.48×104L·mol-1.將圖5與圖4相比較可發(fā)現(xiàn),用Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程處理散射體系與處理熒光體系得到的結(jié)果非常相似,比較表1和表2,所得猝滅常數(shù)KSV、靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB都在相同的數(shù)量級(jí)范圍內(nèi).兩種光譜得到的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及表觀結(jié)合常數(shù)也非常接近.說(shuō)明熒光猝滅理論同樣適合藥物對(duì)蛋白質(zhì)共振光散射強(qiáng)度的猝滅.2.4靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)藥物與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等.藥物不同,與蛋白質(zhì)作用力類型不同,當(dāng)溫度變化不大時(shí),反應(yīng)焓變?chǔ)可看作是一常數(shù),由式和表1的靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)可求得MET的ΔrGm、ΔrHm、ΔrSm,見表3.由于ΔrHm>0,ΔrSm>0.從熱力學(xué)角度看,MET主要通過(guò)疏水作用與BSA發(fā)生結(jié)合反應(yīng).2.5臨界能量轉(zhuǎn)移距離通過(guò)測(cè)定甲硝唑吸收光譜并與BSA發(fā)射光譜比較,發(fā)現(xiàn)兩者有較大部分重疊,如圖6所示,說(shuō)明兩者之間存在著能量傳遞過(guò)程.按照F$rster偶極-偶極無(wú)輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理,供能體與受能體之間的結(jié)合距離(r)、臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)及能量轉(zhuǎn)移效率E符合以下關(guān)系:而臨界能量轉(zhuǎn)移距離(R0)又與偶極空間取向因子K2,供能體熒光量子產(chǎn)率!、介質(zhì)折射指數(shù)n有關(guān):其中J是供能體的熒光發(fā)射光譜與受能體吸收光譜的重疊積分F(λ)為熒光供能體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度,ε(λ)為受能體在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸收系數(shù),將圖6中MET的吸收光譜與BSA的熒光發(fā)射光譜的重疊部分分割成極小的矩形,按式(9)積分,得到J=6.49×10-15cm3·L·mol-1.取向因子取授體-受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的平均值K2=2/3;BSA中色氨酸殘基的量子產(chǎn)率φ=0.118;折射指數(shù)取水和有機(jī)物的平均值n=1.336;由式(8)得到能量轉(zhuǎn)移臨界距離R0=2.28×10-7cm;能量轉(zhuǎn)移效率E由(10)式計(jì)算得E=0.124,再根據(jù)(7)式進(jìn)一步求出MET與BSA的結(jié)合距離r值為3.16nm.2.6甲硝唑?qū)Φ鞍踪|(zhì)同步熒光光譜的影響對(duì)于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜,Δλ=15nm只表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光,Δλ=60nm時(shí)只表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光.因?yàn)榘被釟埢淖畲蟀l(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的疏水性有關(guān),因此由發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化.圖7為甲硝唑?qū)Φ鞍踪|(zhì)同步熒光光譜的影響,可見酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)基本保持不變,而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)紅移,表明甲硝唑的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生變化,色氨