水稻組織培養(yǎng)研究進展

水稻組織培養(yǎng)研究進展

集體培訓技術是農業(yè)高科技中最重要、最活躍的領域之一。它不僅是農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎，也是生物技術應用最廣泛、最現(xiàn)實的領域。被稱為農業(yè)史上的“第四次綠色革命”，對解決經濟和社會發(fā)展面臨的人口增長、農業(yè)資源貧寒、環(huán)境保護等重大問題具有重要的戰(zhàn)略意義。進行植物組織培養(yǎng),只需要少量的材料就能獲得大量的植株,不僅可節(jié)約大量種子、肥料,而且還節(jié)約了大量的耕地,目前組織培養(yǎng)技術已被廣泛應用于水稻、蘭花、月季、蘆薈、馬鈴薯等植物的工廠化生產中,并取得了巨大的經濟和社會效益。本文從影響水稻組織培養(yǎng)的各種因素及其應用等方面對近年來的研究進行綜述,以便給相關研究者提供參考。1影響水稻集體培訓的因素1.1種外植體間的愈傷組織誘導率和綠苗分化率外植體是指植物組織培養(yǎng)中用來進行離體無菌培養(yǎng)的材料,如器官、組織、細胞和原生質等。水稻不同外植體的組織培養(yǎng)效果好壞對水稻育種有很大的影響。目前我國水稻育種仍處于以傳統(tǒng)手段為主的階段,即采用兩親本雜交,然后通過系譜法來選擇優(yōu)良后代,后代性狀依舊接近于兩親本,變異來源較窄。近年來隨著生物技術手段的不斷發(fā)展,組織培養(yǎng)技術已經廣泛應用于水稻育種中,然而目前多數(shù)育種單位選用的都是花藥培養(yǎng)結合常規(guī)手段。事實上,采用不同外植體進行組織培養(yǎng)都能夠獲取更多的變異,但是選用哪種外植體的綠苗分化率最高且最易獲取有利變異目前還未見報道。在水稻不同外植體的組織培養(yǎng)研究中,目前研究最多的為花藥、幼穗、幼胚、成熟胚等4種外植體,但是不同品種、不同外植體之間愈傷組織誘導率、綠苗分化率都有較大的差異。鄭文靜等研究表明,4種外植體中以成熟胚為外植體時誘愈率最高,幼胚和幼穗為外植體誘愈率次之,取花藥為外植體時雜交組合的誘愈率比常規(guī)品種稍高,除遼粳294外都在10%以內。在對組織培養(yǎng)后代的變異率調查中發(fā)現(xiàn),以成熟胚為外植體的后代有利變異率最高,花藥培養(yǎng)次之。王秀紅等對于水稻不同基因型不同外植體培養(yǎng)效果及其相關性分析研究表明,幼穗、幼胚和成熟胚的愈傷組織誘導率均顯著高于花藥的愈傷組織誘導率;幼穗和幼胚綠苗分化率差異不顯著,但均顯著高于成熟胚和花藥,成熟胚的綠苗分化率也顯著高于花藥。對同一基因型不同外植體間的愈傷組織誘導率和綠苗分化率分別進行相關性分析,結果表明,花藥與幼穗、成熟胚的愈傷組織誘導率存在顯著正相關,幼穗和幼胚的愈傷組織誘導率也存在極顯著正相關。不同外植體的綠苗分化率之間不存在相關性,愈傷組織誘導率和綠苗分化率不存在顯著的相關性。姜大剛等以我國特有的溫敏不育系秈稻品種安農S-1及其轉育的不育系安湘S和香125S為材料,對不同外植體愈傷組織進行研究,在所選用的3個水稻品種中,成熟胚的愈傷組織誘導率均在90%以上,而且誘導的愈傷組織性狀較好;而以幼胚為外植體誘導愈傷組織時,香125S的誘導率明顯高于安農S-1和安湘S。胚性愈傷組織的繼代成功率,不論對于幼胚還是成熟胚來說,香125S都明顯高于安農S-1和安湘S?？梢娝酒贩N不同,其外植體的誘導率也有差異。1.2不同消毒劑對愈傷組織誘導率的影響外植體在接種之前,須經嚴格滅菌。目前外植體滅菌多采用酒精和氯化汞,其中酒精具有較強的殺菌力、穿透力和濕潤作用。酒精和氯化汞處理的時間過長或過短都不利于滅菌,過短滅菌不徹底,過長雖然污染率降低但也會影響愈傷組織誘導率,所以應嚴格把握滅菌的時間。滅菌組合方式一般有:(1)70%酒精消毒3min,再用0.1%氯化汞消毒15～18min,最后用無菌水洗凈;(2)70%酒精浸泡種子1min,然后用2.5%NaClO浸泡20～30min,用無菌水沖洗種子4～5次,并浸泡過夜;(3)將水稻種子去殼后用70%酒精消毒1min,再用體積比為1∶1的0.1%氯化汞和2%NaClO的混合消毒液浸泡20min,最后用無菌水沖洗3～5遍,用濾紙吸去多余的水分。1.3分離培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導通常以M8、N6、MS、AA、1/2MS為水稻組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。其中1/2MS主要用于生根培養(yǎng),AA主要用于水稻懸浮細胞培養(yǎng)。NB和NMB是目前水稻轉化培養(yǎng)中最常用的組合培養(yǎng)基,劉香玲等的研究表明,這2種培養(yǎng)基各有利弊,把NB和NMB組合起來使用比單獨使用效果更好,誘導的胚性愈傷組織更多且胚性強、生長和分裂旺盛、分化率高。此外在基本培養(yǎng)基中添加一些物質對其進行改良,如改良型M8培養(yǎng)基,也顯現(xiàn)出了良好的應用效果。馮雙華等在對不同因素對水稻溫敏核不育系香125S花藥培養(yǎng)影響的研究中引用了改良M8培養(yǎng)基,結果發(fā)現(xiàn)其愈傷組織誘導率顯著高于N6和M8,利用改良M8培養(yǎng)基誘導的愈傷組織,平均綠苗產量也顯著高于利用M8和N6,不同培養(yǎng)基對花藥愈傷組織誘導效果有顯著差異,表現(xiàn)為改良M8>M8>N6。張智奇等利用2種培養(yǎng)基N6和MS對水稻幼穗進行愈傷組織誘導,經過繼代培養(yǎng)原生質體游離,最終都形成了再生植株,但基本培養(yǎng)基N6比MS更為有效地促進植株再生而得到白化苗。張堯忠等的研究結果也表明,N6分化培養(yǎng)基的再生綠苗率極顯著高于MS培養(yǎng)基。這說明,在利用水稻器官進行愈傷組織誘導時,N6培養(yǎng)基是較好的選擇。為了提高培養(yǎng)效果,又有研究人員對N6培養(yǎng)基進行進一步完善和改良。徐明良等在N6培養(yǎng)基中加入2μg/L2,4-D,結果懸浮細胞和原生質體都獲得了高頻分裂;吳家道等利用N6培養(yǎng)基的大量元素、MS培養(yǎng)基的微量元素和B5有機物顯著提高了原生質體培養(yǎng)的植板率。李良材等在進行水稻懸浮細胞的培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),在AA培養(yǎng)基中加入一定濃度的ABA有利于原生質體的存活和分裂。愈傷組織的繼代能力是水稻離體培養(yǎng)再生體系必須考慮的重要方面,與來源于幼胚、幼穗的愈傷組織相比,來源于成熟胚的愈傷組織繼代更難。外源生長素是繼代培養(yǎng)基中必不可少的成分,2,4-D是首選的激素種類,但是不同的品種對濃度有不同的要求。蔗糖是水稻組織培養(yǎng)最基本和最常用的碳源。研究表明,不同的外植體誘導愈傷組織需要添加的蔗糖濃度不同,如成熟胚為30g/L、幼穗為40g/L、花粉為60g/L等。李霞等對不同濃度蔗糖對成熟胚的成愈率和質量的影響研究表明,適當增大蔗糖濃度可以提高成熟胚的出愈率,并且提高愈傷組織質量,但60g/L則會明顯降低出愈率,影響愈傷組織質量。另外在誘導培養(yǎng)基中加入毒素對幼胚的篩選有較好效果,可以獲得較多的胚性愈傷組織和較多的分化苗。培養(yǎng)基中毒素的處理濃度以30%效果最好。維持培養(yǎng)基中的滲透壓對愈傷組織的質量有十分重要的作用。通常使用不同濃度的山梨醇或甘露醇等物質來提高胚性細胞誘導及保持培養(yǎng)基滲透壓;但如果使用濃度不當很容易使組織褐化或死亡,而通過提高誘導培養(yǎng)基的蔗糖濃度(50g/L),可增加碳源并調控滲透壓、提高誘導率,一舉多得。楊躍生認為培養(yǎng)基中的Cu2+含量對植株的再生有明顯影響。也有報道選擇不同植物生長調節(jié)物質處理和高濃度瓊脂粉固體分化培養(yǎng)添加TDZ、甘露醇、亞精胺及脫水處理和兩步分化法等可提高水稻愈傷組織成苗率。此外,在分化培養(yǎng)基中添加適量Na2SiO3,可明顯提高水稻愈傷組織成苗率。1.4外源激素對愈傷組織生長的影響水稻組織培養(yǎng)中,影響因素是多方面的,而激素是影響愈傷組織誘導和綠苗分化的關鍵性因素。目前水稻愈傷組織的誘導使用最多的激素是2,4-D。李玉靜等研究表明,2,4-D是誘導愈傷組織必不可少的因子,其與6-BA配合使用對種胚愈傷組織的誘導效果不同。從愈傷組織誘導率上看,2.0mg/L2,4-D與0.5mg/L6-BA配合誘導率最高,4.0mg/L2,4-D與0.2mg/L6-BA配合誘導率最低,2.0mg/L2,4-D與6-BA配合的種胚愈傷組織誘導率較大,因此可以認為2.0mg/L的2,4-D比較適合于種胚愈傷組織誘導,這也與大多數(shù)有關報道相似。如果誘導愈傷組織在使用了2,4-D的基礎上再添加ABA、6-BA、KT等激素,則對秈稻的成愈率、愈傷組織質量和胚性有明顯作用,可獲得較高的誘導率,而對粳稻的愈傷組織的誘導作用不大,可見不同的基因型對激素的敏感性不同。6-BA是一種活性較強的細胞分裂素,在植物組織培養(yǎng)中的主要功能是促進細胞的分裂和芽的形成,可以提高花粉胚狀體的產生和增強形成根的趨勢,對分化成苗起主導作用。ABA目前被認為對誘導愈傷組織及保持愈傷組織胚性有一定作用,特別對秈稻的作用更明顯。各類植物激素的生理作用雖有相對專一性,但是植物的各種生理效應是不同種類激素之間相互作用的綜合表現(xiàn),植物細胞離體培養(yǎng)、誘導脫分化和再分化過程更非某類激素單獨作用的結果。王冬梅等研究表明,2,4-D和6-BA是誘導分生愈傷組織、胚胎細胞和胚狀體所必需的因素;但在誘導過程中,2,4-D濃度應逐步降低,否則愈傷組織細胞不能成為胚胎細胞,而提前分化生根表明組織培養(yǎng)中生長素含量過高不利于胚胎發(fā)生。6-BA有協(xié)同生長素的性質,但不直接參與胚胎發(fā)生。胚狀體產生后2,4-D和6-BA則抑制其進一步發(fā)育,這可能與胚產生內源激素有關。田文忠發(fā)現(xiàn),添加2mg/L2,4-D的誘導培養(yǎng)基上生長的愈傷組織比較松軟,呈黏液化和泡泡狀,一般不易分化,轉移到再生培養(yǎng)基中后,僅能得到10%以下的再生頻率;但在誘導培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基上添加NAA和KT后,可以改進愈傷組織的質量,從外形上看,愈傷組織比較致密、較硬、顆粒狀結構、易于分化,可以提高秈稻的再生頻率。在進行水稻組織培養(yǎng)時,秈稻比粳稻要求更高的激素水平,培養(yǎng)液中添加的外源激素的種類和含量對愈傷組織質量有影響,因此水稻愈傷組織的培養(yǎng)是受內源激素和外源激素共同影響的。各內源激素在水稻遺傳轉化過程中有著不同的作用:IAA主要存在于愈傷組織的芽中,而剝離后的種胚中較少,且過高的IAA不利于愈傷組織的誘導和生長,可以通過ABA來消除它的不利影響;ZR主要存在于誘導愈傷組織的種胚中,有促進分裂和生長的作用,對愈傷組織誘導時的啟動有決定作用,如果外植體的ZR含量太低,即使有較高的IAA也不能誘導出愈傷組織,在抗性篩選后秈稻愈傷組織中ZR含量偏低可能是造成秈稻轉化率不高的原因之一。過高的ABA對愈傷組織的誘導不利,但在繼代培養(yǎng)基中適量提高ABA濃度有利于胚性愈傷組織的形成。ABA對胚胎愈傷組織的發(fā)生有良好的作用,可以增加愈傷組織的致密度和分生細胞的數(shù)目,且有利于愈傷組織的誘導和再生能力的保持,降低分化過程中的發(fā)芽率。體細胞的發(fā)生受外源ABA與內源ABA共同調節(jié),在ABA濃度適宜時,能抑制多種異常體細胞胚的發(fā)生,而且外源ABA加入培養(yǎng)基的時間愈早其效應愈顯著。ABA能誘導乙烯生成,而乙烯對愈傷組織細胞有傷害作用。因此,在培養(yǎng)基中附加ABA的時間不能過長,通常為1～2周。愈傷組織分化時較高的ABA/IAA比值有利于芽的形成。1.5不同處理對水稻愈傷組織再生的影響干燥處理、低溫處理、光處理、非植物激素類化學試劑處理均能有效促進水稻愈傷組織綠苗分化。干燥處理能促進水稻愈傷組織對礦質元素的吸收,影響過氧化物酶(POX)基因表達,降低脯氨酸含量。譚光軒等認為干燥處理可能引起愈傷組織mRNA的代謝和POX活性升高,從而降低水溶性蛋白、吲哚乙酸水平,影響愈傷組織胚狀體發(fā)育進程,提高野生稻綠苗分化率;王春艷等認為高溫會加速分化能力的衰減,適當降低培養(yǎng)溫度有利于愈傷組織保存和胚性保持;愈傷組織的分化采用“先暗后光”的方法,即愈傷組織適應低生長素、高細胞分裂素的分化培養(yǎng)條件并開始生長之后,每天給予14h1000～2000lx的光照,結果愈傷組織老化率減小,再生植株頻率提高了7.5倍;培養(yǎng)基中以淀粉代替瓊脂,即用0.2%瓊脂+2.0%水稻或小麥淀粉可促進出愈率,這可能是因為培養(yǎng)基表面有一薄層液體,使水稻充分吸收培養(yǎng)基的養(yǎng)分和水,但又不會下沉,有良好的透氣性。另外培養(yǎng)基中的淀粉在水稻淀粉酶作用下分解成可利用的碳源。降低分化培養(yǎng)基中蔗糖的含量,加入適量山梨醇可明顯提高水稻愈傷組織的再生植株頻率,多個品種分化頻率均在75%以上。此外低濃度的二甲塞亞鞏對植株再生有促進作用,但品種間存在差異。長期繼代培養(yǎng)引起愈傷組織再生能力衰退的問題已被很多學者所認識和重視,針對其衰退的原因也有比較深入的生理生化研究。鄭貴朝等在研究中采用脫水處理、添加亞精胺、Cu2+或山梨醇等能在某種程度上恢復愈傷組織的再生能力。愈傷組織的再生培養(yǎng)一般是使用含有BA和NAA的培養(yǎng)基直接獲得植株,然而這個方法在很多情況下培養(yǎng)效率不高。為了解決這個問題,有學者研究并報道了在誘導植株再分化的培養(yǎng)之前,在繼代培養(yǎng)中添加山梨醇或甘露醇或在分化培養(yǎng)基中加入亞精胺能提高愈傷組織的再分化能力;楊躍生等也報道了創(chuàng)造良好的通氣條件、對愈傷組織進行適度的脫水處理和添加較高濃度Cu2+的方法,其中以添加Cu2+的處理最為方便,并適合于組培的每個環(huán)節(jié)。袁云香等的研究表明,采用三步分化法的出愈率和成苗率均高于兩步分化法和直接分化法。此外,酚類物質是水稻愈傷組織褐化的主要原因,減少酚類物質也能改善愈傷組織質地及提高分化率。近年來有研究表明,鈣處理對愈傷組織的生長及分化有較大的影響;鈣可以誘導煙草外植體的分化、開花和生根。適當增大培養(yǎng)基中的鈣濃度可提高水稻愈傷組織的相對生長量、分化率、再生植株生根條數(shù)及根長。2研究和開發(fā)水稻組織2.1水稻花藥培養(yǎng)及生化材料的制備水稻單倍體在遺傳上具有無顯隱性、易表達、加倍后即純合等優(yōu)勢。對水稻單倍體的誘導,特別在利用方面進行了很多研究。在生物技術領域,花藥培養(yǎng)被公認為能最早轉化為生產力,在品種改良上發(fā)揮作用并產生重要影響度的技術。據(jù)不完全統(tǒng)計,自從1975年審定第一個花培品種單豐1號以來,全國已有20多個花培品種通過審定。但秈稻品種較少,主要是由于秈稻花藥培養(yǎng)率很低。楊長登等以秈稻單倍體無性系微芽為材料進行愈傷組織的誘導、分化,擴增微芽后,用秋水仙素浸泡48h放在分化培養(yǎng)基上長苗,獲得二倍體,微芽經過愈傷組織后自然加倍率達74%。郭秀平等用同源四倍體水稻種質資源為材料,通過水稻花藥培養(yǎng)的減倍,得到新種質高頻系A87203,該材料1個芽叢培養(yǎng)1個月,芽數(shù)可增殖150～200倍,高的可達350倍以上。沈圣泉等對引進的中秈品系3027進行射線誘變處理,而后結合幼穗培養(yǎng),從誘發(fā)產生的變異后代中成功選育優(yōu)異恢復系突變體R3027,配制出強優(yōu)勢雜交水稻新組合,展現(xiàn)了良好的應用前景。2.2成熟種子誘導愈傷組織的誘導表達稻瘟病是水稻的主要病害之一。稻瘟病菌在代謝過程中產生致病毒素,用粗毒素接種可產生與病原菌侵染相同或類似的病癥。原因是毒素在生理濃度范圍內會干擾植物的生理功能。水稻白葉枯病是水稻最主要的三大病害之一,在我國稻區(qū)每年都有不同程度的危害。趙海巖等用水稻成熟胚、花藥作外植體獲得愈傷組織,在培養(yǎng)基上加稻瘟病菌粗毒素提取液繼代培養(yǎng),將較強活力的愈傷組織轉到含稻瘟病菌粗毒素提取液的分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng),田間接種鑒定和天然疫圃種植鑒定,獲得了2個抗性得以提高的穩(wěn)定品系遼農2號和遼農7號,抗病性較原品種提高了1～3個等級。王莉江等用明恢63的成熟種子誘導愈傷組織,利用基因槍輔助的土壤農桿菌轉化法將天花粉蛋白基因轉入明恢63的愈傷組織,并通過再生獲得了轉基因