利用蔗糖密度梯度離心法純化偽狂犬病毒

利用蔗糖密度梯度離心法純化偽狂犬病毒

真菌病毒（prv）也被稱為假性病毒（prv），屬于官僚病毒甲科植物。偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的家畜和多種野生動物的一種以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)疾病為特征的急性傳染病,又稱Aujeszky病,在世界各地流行。偽狂犬病毒可引起豬、牛、羊、犬、貓、家兔、小白鼠、水貂、狐等多種家畜和野生動物發(fā)病,具有高致死率。而豬是該病毒增殖感染唯一可存活的宿主,是該病毒的自然儲存庫。所以,從豬群中切斷偽狂犬病毒的傳播是控制偽狂犬病的有效途徑。到目前為止,已有24個省市先后報道該病,給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。并且,豬感染偽狂犬病毒后,免疫系統(tǒng)受到損害,容易繼發(fā)感染其他疾病,如豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合征等,給豬偽狂犬病的防治增加了難度,也給豬病防治提出了新的課題。本研究純化并鑒定偽狂犬病毒,旨在為今后利用其建立雜交瘤細胞株,獲得偽狂犬病毒單克隆抗體以及建立特異的病原診斷方法奠定基礎。1材料和方法1.1低分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)Taq酶、基因組DNA提取試劑盒為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品;引物合成和序列測定由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成;低分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)為上海麗珠東風生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;犢牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;偽狂犬病毒Bartha株購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所;HITACHICR-21GⅡ高速離心機、HITACHICP-100WX超速離心機、DMEM培養(yǎng)基購自美國英杰生命技術(shù)有限公司。1.2方法1.2.1狂犬病毒bartha的培養(yǎng)過程用含10%犢牛血清的DMEM培養(yǎng)幼倉鼠腎細胞(BHK-21)使其生長至單層后,接種適當稀釋的偽狂犬病毒Bartha株1mL,于5%CO2、37℃條件下孵育1h后,每瓶加8~10mL含2%犢牛血清的DMEM維持液,培養(yǎng)60h后收獲。第1代無典型細胞病變,盲傳2代后,開始出現(xiàn)典型的細胞病變,傳至21代,都出現(xiàn)典型的細胞病變。將BHK-21細胞培養(yǎng)物反復凍融3次后收集,置-20℃?zhèn)溆谩?.2.2基因組dna提取將病毒的細胞培養(yǎng)液反復凍融3次后,以5000r/min離心30min,取沉淀,按基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3pcr擴增過程根據(jù)參考文獻合成1對引物,上游引物P1:5′-CACGGAGGACGAGCT-GGGGCT-3′,下游引物P2:5′-GTCCACGCCCCGCT-TGAAGCT-3′,以提取的病毒DNA為模板進行PCR擴增,擴增長度為217bp。PCR反應體系為20μL,循環(huán)參數(shù)為:94℃預變性4min;94℃1min,65℃1min,72℃1min,30個循環(huán);最后72℃延伸10min。擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。1.2.4設立2%微生物指標將凍融的PRV細胞培養(yǎng)液做10倍系列稀釋,接種至已鋪滿單層BHK-21細胞的96孔培養(yǎng)板中,每稀釋度接種8孔,于5%CO2、37℃條件下吸附1h。最后3列作為對照組,每孔加0.1mLPBS。然后按0.1mL/孔加入2%犢牛血清的DMEM。于5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)。每日觀察記錄細胞病變情況,144h后終判,按Karber法計算病毒滴度。1.3沉淀用微膠凝劑pbs細胞培養(yǎng)物于4℃下8000r/min離心30min,取上清,再在4℃下25000r/min離心2.5h,沉淀用少量0.01mol/LPBS(pH7.2)重懸。以PBS配制質(zhì)量分數(shù)為30%、35%、40%、45%的不連續(xù)蔗糖梯度溶液,加樣品至梯度界面上,4℃、26000r/min離心2h,吸取蛋白帶至離心管內(nèi),加PBS以30000r/min離心1h去蔗糖,沉淀以PBS溶解,-80℃保存?zhèn)溆谩?.4病毒蛋白質(zhì)含量的測定利用752型紫外光柵分光光度儀(上海第三分析儀器廠),測定260nm和280nm波長處病毒樣品的OD值。1.5直平板電泳將病毒樣品煮沸變性后,進行SDS垂直平板電泳。60mA電壓下電泳約3h,用考馬斯亮藍R250染色2~4h。參照標準分子質(zhì)量蛋白遷移率,測算出病毒樣品電泳條帶對應的分子質(zhì)量。2結(jié)果與分析2.1prv在brk細胞上的增殖培養(yǎng)BHK細胞接種PRV后,第1代細胞無特異性病變出現(xiàn),盲傳2代后,開始出現(xiàn)特異性的細胞變圓、脫落,形成合胞體的病變(圖1)。這說明PRV在BHK細胞中復制并增殖,對細胞的生長產(chǎn)生了特定的影響。由瓊脂糖凝膠電泳圖譜可見,在217bp左右處出現(xiàn)1條與預期大小一致的條帶(圖2)。測序也證實待純化的細胞液中確實存在豬偽狂犬病毒。2.2稀釋度的確定Karber法計算病毒滴度公式為:lgTCID50=L-d(s-0.5),其中L=最高稀釋度的對數(shù);d=稀釋對數(shù)之間的差;s=陽性管比率總和。根據(jù)表1中數(shù)據(jù),得lgTCID50=L-d(s-0.5)=-1-1×(1.75-0.5)=-2.25,病毒滴度為103.25TCID50/mL,所得病毒毒力偏低,可能是由于培養(yǎng)病毒時所加維持液偏多的緣故。2.3采后感染的豬偽狂犬病毒的細胞系統(tǒng)接毒的BHK-21細胞電泳條帶與未接毒細胞相比,在40kD附近出現(xiàn)了2條新增條帶(圖3),這2條帶在提純的病毒中依然存在。這表明在接毒后,細胞內(nèi)的蛋白組成已經(jīng)發(fā)生變化,這些新增的蛋白很可能是組成病毒的蛋白。提純病毒共出現(xiàn)5條蛋白帶,分子質(zhì)量為30~97kD,其蛋白大小與報道的豬偽狂犬病毒各蛋白大小基本相當。由圖3可見,經(jīng)蔗糖密度梯度離心后,病毒純度有明顯提高。3brk-21細胞增殖特點一般采用在低倍顯微鏡下觀察細胞病變來判斷病毒是否在細胞系中增殖。細胞病變是病毒在細胞內(nèi)增殖及其對細胞產(chǎn)生損害的最明顯的表現(xiàn),包括胞漿的顆粒變性、胞核的變形和碎裂等,而且經(jīng)常導致細胞的完全破壞。細胞病變的出現(xiàn),一般可認為是病毒增殖的確切證據(jù)。接毒BHK-21細胞出現(xiàn)了明顯的細胞變圓,脫落,形成合胞體的特異性病變。病毒樣品經(jīng)超速離心濃縮和蔗糖密度梯度離心后,每一界面均