維帕米預處理對黃土鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

維帕米預處理對黃土鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

目前，對腦損傷再注射損傷的發(fā)病機制尚不清楚。許多科學家認為，這是一種多路徑的損傷機制，包括能量代謝障礙、微循環(huán)障礙、細胞內鈣含量超標、自由基損傷、興奮性氨基酸異常等。其中腦缺血可以引起Ca2+超載,而Ca2+超載又可引起并加重腦缺血損害,二者形成惡性循環(huán),因而細胞內Ca2+超載被認為是腦缺血再灌注損傷最重要的作用機理之一。維拉帕米(異搏定)是較早被研究的鈣通道阻斷劑,臨床已廣泛用于治療心血管疾病。有實驗證實維拉帕米對腦缺血損傷后的腦組織也有一定的保護作用,但關于它用于藥物預處理的腦保護研究,目前還未見相關報道。本實驗在不同時間點對沙土鼠行維拉帕米預處理,觀察沙土鼠缺血損傷后超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性、內皮素(ET)和降鈣素基因相關肽(CGRP)等生化指標以及形態(tài)學的改變,來探討其對沙土鼠的腦保護機制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1隨機分組及分組33只蒙古種沙土鼠(昆明藥理重點實驗室提供),月齡3個月,體質量42~75g,隨機分為對照(A)組、腦缺血再灌注損傷(B)組、維拉帕米預處理(C、D、E)組,A、B組各為6只,C、D、E組各為7只。C、D、E組在腦缺血前48、24、12h分別予2.5%維拉帕米(2mg/kg·b.w.)腹腔注射,并觀察動物的注藥反應。1.1.2試劑盒和試劑盒2.5%維拉帕米注射液由上海禾豐制藥有限公司生產,SOD試劑盒、GSH-px試劑盒和MDA試劑盒由南京聚力生物醫(yī)學工程研究所提供,ET試劑盒和CGRP試劑盒由天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司提供。1.2方法1.2.1成模模式及程序所有動物均在2.5%戊巴比妥鈉(40mg/kg·b.w.)腹腔注射麻醉下行雙側頸總動脈分離術。A組不行腦缺血處理,其余各組用動脈夾夾閉雙側頸總動脈20min,造成沙土鼠前腦缺血,隨后開放血管夾恢復血流,再灌注50min,即制成沙土鼠腦缺血再灌注動物模型。上述操作完畢后,將所有動物立即處死,冰玻上斷頭,分離出左、右大腦皮層(厚約2mm),去除血管和硬腦膜,分裝入液氮儲存管保存于液氮中待用。1.2.2酸ph值的測定方法取右側前大腦皮層組織,吸去血跡,稱質量,盡快放入0.1mol/L乙酸1ml略做研磨,然后在100℃水浴中煮沸10min,取上清于-20℃保存待測。測定時用磷酸緩沖液(PBS)5倍稀釋,以調節(jié)pH值。ET與CGRP的含量均采用放射免疫方法測定。1.2.3水溶液研磨法取左側前大腦皮層組織,吸去血跡,稱重,在冰玻上按1∶4與生理鹽水研磨制成勻漿,4℃3000r/min離心15min,取上清液于液氮中保存待測。SOD活性、GSH活性及MDA含量測定均采用比色法。1.2.4透射電鏡觀察每組隨機選取一只沙土鼠,在冰玻上取左顳前葉腦組織切成大小約1mm×1mm小塊,依次經3%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定、梯度丙酮脫水、環(huán)氧樹脂618與丙酮浸透、環(huán)氧樹脂618包埋、LKB-V型超薄切片機切片、醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色后,行透射電鏡觀察。1.2.5統(tǒng)計分析測定值用均數±標準差表示,采用SPSS10.0軟件分析數據,組間比較用F和q檢驗,以P<0.05為顯著性差異。2結果2.1各組的sod活性、mda含量比較各組腦組織勻漿SOD、GSH、MDA值的比較見表1。與A組比較,B組SOD及GSH活性明顯低下,而MDA含量顯著增高;與B組比較,維拉帕米預處理各組的GSH活性均顯著高于B組,C、D組的SOD活性顯著高于B組,E組的SOD活性高于B組,但無統(tǒng)計學意義;C、D組的MDA含量顯著低于B組,E組的MDA含量低于B組,但無統(tǒng)計學意義。維拉帕米預處理各組從均值看,E組的SOD、GSH活性高于其它預處理組,而MDA含量低于其它預處理組,但它們的差異不具有統(tǒng)計學意義。各組腦組織勻漿中ET、CGRP、ET/CGRP比值比較見表2,與A組比較,B組ET、ET/CGRP比值顯著高于A組,CGRP含量顯著低于A組;與B組比較,維拉帕米預處理各組的ET、ET/CGRP比值均顯著低于B組,CGRP含量高于B組,但差異不具有統(tǒng)計學意義;維拉帕米預處理各組中,E組的ET、ET/CGRP比值低于其它組,但它們之間無顯著性差異。2.2拉克氏原螯蝦胞質正常對照組的大腦皮質細胞超微結構正常,細胞膜規(guī)整清晰,細胞質比較均勻,線粒體嵴較多且排列整齊,線粒體膜完整(圖1);缺血組細胞膜明顯腫脹擴張,有皺折表現,內質網腫脹擴張,甚至有空泡狀改變,線粒體腫脹破裂,線粒體嵴斷裂消失(圖2);維拉帕米預處理48h組胞膜清晰無皺折,細胞質比較均勻,線粒體嵴僅部分斷裂,內質網及高爾基體無或僅輕度腫脹擴張(圖3);24h組胞膜較規(guī)則,胞質稍疏松,線粒體嵴部分斷裂,內質網略腫脹(圖4);12h組的細胞質疏松較明顯,細胞膜有輕微皺折改變,線粒體嵴斷裂、消失,有空泡改變,內質網腫脹較明顯(圖5)。3基于抗氧化磷酸化過程的活性成分變化鈣通道阻滯劑是一類選擇性阻滯電壓依賴性鈣通道,抑制細胞外Ca2+經慢通道進入細胞,降低細胞內Ca2+濃度的藥物,因而可消除上述有害因素,有一定的腦保護作用。本實驗應用維拉帕米作預處理來研究其在腦缺血再灌注損傷中的腦保護作用。SOD和GSH是中樞神經系統(tǒng)中重要的抗氧化酶,SOD能清除超氧陰離子自由基O2-,GSH能清除H2O2。如果SOD活性增高而不伴有GSH活性的升高,則使生成的H2O2不能及時被清除而轉化為·OH,因此,SOD的活性升高反而有害。本實驗結果表明,腦缺血再灌注組,這兩種酶的活性均顯著下降,可能是ATP耗竭不能提供足夠的能量,氧自由基對酶的直接破壞作用。給予維拉帕米預處理能夠同時抑制這兩種酶活性的下降,其中以48h預處理的作用最強。推測其機理為:維拉帕米通過抑制鈣內流,恢復氧化磷酸化過程,從而增強了SOD和GSH的活性以及減輕了氧自由基對抗氧化酶的破壞作用。MDA是一種脂質過氧化的終產物。腦組織中富含脂質且所含的抗氧化酶較少,在腦缺血缺氧時容易受到氧自由基的攻擊,發(fā)生脂質過氧化反應,產生一些中間產物,并降解成一些小分子終產物,如醛類、酮類及羧酸等,尤以醛類中的MDA最為重要,往往把MDA作為衡量脂質過氧化和氧自由基損害程度的重要指標。MDA產生后可以與細胞膜蛋白上的氨基及巰基發(fā)生反應,導致膜蛋白的交聯和凝聚,使膜蛋白失去活性,從而喪失轉運功能,導致細胞內外離子交換障礙引起鈣離子的超載,引起腦組織細胞的病理性損傷。本實驗顯示,腦缺血再灌注后沙土鼠腦組織中的MDA水平顯著增高,說明腦組織缺血后使腦內脂質過氧化程度明顯加劇。而維拉帕米預處理能降低腦缺血再灌注損傷時腦組織的MDA水平,從而減少MDA對腦組織的損害,且以48h預處理的作用最強,表明氧自由基對多價不飽和脂肪酸的攻擊減少,脂質過氧化水平降低,而這種保護作用的高峰出現在給藥后48h左右。脂質過氧化水平的降低也提示維拉帕米能夠降低腦內氧自由基的含量,維拉帕米的神經保護作用與降低脂質過氧化水平密切相關。腦缺血時,內皮細胞受到強烈刺激,導致ET異常表達和釋放增加。在動物實驗中也發(fā)現腦缺血急性期血漿ET濃度增高,且與缺血腦組織中的變化相一致。而且,神經系統(tǒng)損害越嚴重,血漿ET水平越高,血漿ET含量與疾病嚴重程度呈正相關趨勢。CGRP被認為是內源性ET拮抗劑,是迄今所知體內最強的舒血管物質,廣泛分布于中樞和外周神經系統(tǒng)及腦血管系統(tǒng),對腦血管舒縮功能調節(jié)有著重要作用。ET、CGRP作用相反,又呈相關性,正常情況下兩者保持相對穩(wěn)定,呈動態(tài)平衡,腦缺血時平衡失控,引起強烈持久的相互拮抗,使腦血管處于收縮狀態(tài),腦組織損傷加重。本實驗結果表明,維拉帕米預處理可明顯減輕腦缺血后腦組織ET水平,增加CGRP水平。臨床上評價腦保護措施的效果,都是以能否降低死亡率、能否改善腦缺血缺氧所引起的中樞神經系統(tǒng)損害后果為標準,而在實驗室則以能否減輕或避免缺血