煙草黃瓜花葉病毒病的防治研究

煙草黃瓜花葉病毒病的防治研究

黃瓜花葉病毒（cmv）屬于麥托中毒的科成員。它是分布最廣泛、影響最大、最具經(jīng)濟(jì)意義的病毒之一。世界范圍內(nèi)所有煙草和蔬菜種植區(qū)均有該病毒的分布和危害,可侵染約36科雙子葉和4科單子葉的千余種植物。煙草和蔬菜感染后造成品質(zhì)和產(chǎn)量下降,甚至絕收,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。真菌多糖是存在于大型真菌子實(shí)體、菌絲體中通過(guò)糖苷鍵連接多個(gè)單糖而構(gòu)成的高分子聚合物。真菌多糖資源豐富、具有豐富的生物活性,而且易被微生物降解、對(duì)環(huán)境無(wú)污染,是目前及具開(kāi)發(fā)前景的藥物新資源。安絡(luò)小皮傘(Marasmiusandrosaceus)系擔(dān)子菌綱、白磨科小皮傘屬真菌,主要活性組分是水溶性多糖,相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明其水溶性多糖具有提高機(jī)體免疫力,抗腫瘤等多種活性,是一種傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛和抗風(fēng)濕的保健中藥,對(duì)人體無(wú)毒副作用。醫(yī)學(xué)研究表明,真菌多糖可通過(guò)抑制病毒吸附、干擾病毒復(fù)制和提高機(jī)體免疫力等途徑,有效抑制人體病毒病的侵染傳播。Collins等發(fā)現(xiàn)云芝多糖不但能抑制HIV-1與宿主細(xì)胞結(jié)合,而且能顯著抑制HIV-l逆轉(zhuǎn)錄酶活性,從而抑制病毒復(fù)制。但真菌多糖對(duì)植物病毒的抑制作用鮮見(jiàn)報(bào)道,吳艷兵發(fā)現(xiàn)毛頭鬼傘多糖對(duì)TMV具有較強(qiáng)的體外鈍化及抑制TMV侵染復(fù)制作用,可有效預(yù)防TMV病毒病。許玉娟發(fā)現(xiàn)噴施蒼耳多糖后,可有效抑制TMV侵染心葉煙,推測(cè)可能是蒼耳多糖通過(guò)誘導(dǎo)增強(qiáng)防御酶活性進(jìn)而抑制TMV。為了篩選得到對(duì)煙草上黃瓜花葉病毒病(CMV)具有顯著抑制作用的真菌多糖,明確真菌多糖處理對(duì)煙苗相關(guān)防御酶的影響,本實(shí)驗(yàn)將采用半葉法,從安絡(luò)小皮傘多糖等21種真菌多糖中篩選出對(duì)(CMV)具有顯著抑制作用的多糖,并探索其對(duì)煙苗相關(guān)防御酶活性變化的影響,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)安絡(luò)小皮傘多糖防治CMV病毒病提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗(yàn)中的茶多酚表1中21種多糖均由本實(shí)驗(yàn)室提取、制備和純化,并于鋁箔袋密封室溫保存?zhèn)溆谩?.1.2sicamacumvar.nc29枯斑三生煙(Nitcotianatabacumvar.SamsunNN)、普通煙NC-89(Nitcotianatabacumvar.NC89),由陜西省煙草研究所提供。所用育苗物質(zhì)經(jīng)消毒后,于防蟲(chóng)溫室內(nèi)種植。1.1.3煙草的保存黃瓜花葉病毒(CucumberMosaicVirus,CMV),為西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院保存在防蟲(chóng)溫室中普通煙草上。制備供試病毒接種液時(shí),取1gCMV感病葉片,加少量石英砂,于10mLPBS溶液中研磨成勻漿,紗布過(guò)濾,無(wú)菌水稀釋至100mL備用。1.1.4化學(xué)試劑及儀器鄰苯二酚,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;L-苯丙氨酸,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;愈創(chuàng)木酚,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;紫外分光光度計(jì)(DU800nucleicacid/proteinanalyzer,購(gòu)于BeckmanCoulter公司);高速冷凍離心機(jī)(Avantiue617J-ECentrifuge,購(gòu)于BECKMANCOULTER公司)。1.2分離、制備多糖本實(shí)驗(yàn)所用的21種多糖均按照改良后的謝紅旗方法提取;菌株子實(shí)體預(yù)處理→沸水浸提→提取液合并、濃縮→乙醇沉淀→冷凍干燥→粗多糖→乙醇沉淀洗滌(3次)→水溶解→Sevag除蛋白→透析→活性炭脫色→透析→冷凍干燥→Molisch反應(yīng)鑒定多糖。1.3抗毒菌和多酚篩選1.3.1供試病毒液和半葉法接種選取7葉期長(zhǎng)勢(shì)一致的枯斑三生煙,打頂,留3-4片葉,培養(yǎng)1周。將50mL稀釋為200和400倍液的21種多糖液分別與等量的供試病毒接種液混合,靜置30min后,用半葉法摩擦接種到煙葉半葉,另半葉摩擦接種清水與供試病毒液混合物為對(duì)照。然后于溫室中培養(yǎng),每處理3株,重復(fù)3次。待出現(xiàn)典型枯斑癥狀后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù),計(jì)算鈍化效果:鈍化效果=(處理半葉枯斑數(shù)-對(duì)照半葉枯斑數(shù))/對(duì)照半葉枯斑數(shù)×100%。1.3.2噴水后接種病毒液將稀釋為200和400倍液的21種多糖液分別噴施到7葉期枯斑三生煙煙葉半葉,另半葉為噴清水對(duì)照。于噴施處理24、48h后,對(duì)各處理及對(duì)照煙葉全葉摩擦接種病毒液。然后于溫室中培養(yǎng),待出現(xiàn)典型枯斑癥狀后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù),計(jì)算預(yù)防效果:預(yù)防效果=(處理半葉枯斑數(shù)-對(duì)照半葉枯斑數(shù))/對(duì)照半葉枯斑數(shù)×100%。1.3.3噴施多糖液將供試病毒接種液摩擦接種到7葉期枯斑三生煙煙苗葉片全葉,分別于處理0,24h后,將稀釋為200和400倍液的21種多糖液噴施到處理煙葉半葉,另半葉為噴施清水對(duì)照。然后于溫室中培養(yǎng),待出現(xiàn)典型枯斑癥狀后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù),計(jì)算治療效果:治療效果=(處理半葉枯斑數(shù)-對(duì)照半葉枯斑數(shù))/對(duì)照半葉枯斑數(shù)×100%。1.4枯斑三烷基糖液的體外藥物藥物處理在2.3實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選擇對(duì)CMV抑制效果最好的多糖,將其稀釋為100、200、400、800倍液等4個(gè)不同濃度的多糖液,采用半葉法在枯斑三生煙上分別測(cè)定其對(duì)CMV的體外鈍化效果、預(yù)防效果及治療效果。1.5安脈小皮病科逐劑的酶活性測(cè)試1.5.1供試病毒接種液制備待普通煙NC-89煙苗長(zhǎng)至3或4片真葉時(shí)作如下處理:處理1,噴施安絡(luò)小皮傘多糖稀釋液不接種供試病毒接種液;處理2,供試病毒接種液與等量的安絡(luò)小皮傘多糖稀釋液混合30min后摩擦接種;處理3,噴施安絡(luò)小皮傘多糖稀釋液24h后摩擦接種供試病毒接種液,以噴施清水不接種供試病毒接種液為對(duì)照。上述處理所用多糖液濃度為200倍稀釋液,供試病毒接種液制備方法同2.1.3。每處理30株,重復(fù)3次。接種后第2、4、6、8、10、12、14天固定葉位取樣(3或4片),制為待測(cè)酶液于-20℃保存?zhèn)溆谩?.5.2ppo及pod酶活性檢測(cè)參照薛應(yīng)龍的方法,稱取0.6g煙葉,放入預(yù)冷的研缽中,加3mL磷酸緩沖液(0.2mol/LpH7.8)冰浴條件下研磨成勻漿。2.85×103g,4℃下離心20min,取上清液于-20℃冰箱內(nèi)保存,測(cè)定PPO及POD酶活。另稱取0.2g煙葉,放入預(yù)冷的研缽中,加2mL硼酸緩沖液(0.2mol/LpH8.7)及少許聚乙烯吡咯烷酮,冰浴條件下研磨,2850×g、4℃離心20min,上清液于-20℃冰箱內(nèi)保存,測(cè)定PAL酶活。1.5.3酶待測(cè)液的制備分別測(cè)定多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和過(guò)氧化物酶(POD)的活性變化。酶提液用相應(yīng)緩沖液稀釋2倍后,分別加入鄰苯二酚、L-苯丙氨酸和愈創(chuàng)木酚為底物制備多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶和過(guò)氧化物酶待測(cè)液。參考朱廣廉的方法,DU800紫外分光光度計(jì)于各酶適合波長(zhǎng)下測(cè)定OD值,每隔1min讀數(shù)一次。每個(gè)樣品重復(fù)3次,以每分鐘OD變化值表示酶活性大小。2結(jié)果和分析2.1真菌多糖對(duì)cmv的預(yù)防效果由表2可看出,21種真菌多糖對(duì)CMV的鈍化效果均低于82%,其中安絡(luò)小皮傘多糖鈍化效果最好,鈍化效果為81.49%,其次為蟲(chóng)草多糖,其鈍化效果為81.35%;21種真菌多糖對(duì)CMV的預(yù)防效果差異顯著,其中,安絡(luò)小皮傘多糖噴施24h后接毒處理對(duì)CMV的預(yù)防效果最好,高達(dá)94.74%,其次為豬苓菌多糖噴施48h后接毒處理,其預(yù)防效果為90.24%,其余處理對(duì)CMV的預(yù)防效果均低于90%;21中真菌多糖對(duì)CMV的治療效果均不明顯,接毒48h后噴施多糖處理對(duì)CMV的治療效果較接毒24h后噴施多糖處理差,其治療效果均低于60%。多糖不同處理方式及濃度均影響其對(duì)CMV的抑制效果,處理方式的影響尤為明顯。2.2安絡(luò)小皮傘多糖對(duì)黃瓜花葉病毒的形態(tài)特征影響依據(jù)抗病毒多糖初篩結(jié)果,選擇鈍化效果及預(yù)防效果相對(duì)較好的安絡(luò)小皮傘多糖,進(jìn)一步測(cè)定不同濃度的安絡(luò)小皮傘多糖對(duì)CMV的抑制效果。從表3可以看出,安絡(luò)小皮傘多糖對(duì)黃瓜花葉病毒的鈍化效果與處理濃度有關(guān),其20倍液對(duì)CMV的鈍化效果最好,為83.41%;安絡(luò)小皮傘多糖對(duì)CMV具有較強(qiáng)的預(yù)防效果,噴施安絡(luò)小皮傘多糖200倍液24h后接毒處理的預(yù)防效果最佳,其預(yù)防效果高達(dá)93.15%,噴施安絡(luò)小皮傘多糖48h后接毒處理的預(yù)防效果隨濃度減小而減弱;安絡(luò)小皮傘多糖對(duì)CMV的治療效果不如預(yù)期好,治療效果均低于65%。2.3生長(zhǎng)活性測(cè)定為了探討安絡(luò)小皮傘多糖抑制煙草上黃瓜花葉病毒病的生理機(jī)制,將采集的煙葉制成酶液,加入相應(yīng)底物后測(cè)定煙葉體內(nèi)POD、PPO和PAL酶的活性變化。2.3.1安絡(luò)小皮傘多糖與現(xiàn)代病毒共作體系中的酶活特征從圖1可看到,各處理組煙葉體內(nèi)POD活性變化顯著,呈先增加后降低的趨勢(shì)。單獨(dú)噴施安絡(luò)小皮傘多糖處理POD酶活變化相對(duì)較小,低于其余兩處理,同時(shí)在第10天出現(xiàn)峰值,出現(xiàn)時(shí)間相對(duì)較晚;安絡(luò)小皮傘多糖與等量病毒液混合30min后接種和噴施安絡(luò)小皮傘多糖24h后接病毒兩處理酶活變化顯著,且在第8天峰值出現(xiàn)后呈現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì),其中,噴施安絡(luò)小皮傘多糖24h后接病毒處理變化最為顯著,其峰值為對(duì)照的2.74倍,其次為安絡(luò)小皮傘多糖與等量病毒液混合30min后接種處理,其峰值為對(duì)照的2.36倍。對(duì)照組酶活幾乎不變,趨于穩(wěn)定,且顯著低于處理。2.3.2安絡(luò)小皮傘多糖保肝作用檢測(cè)pal活性由圖2可看出,各處理煙葉的PAL活性變化顯著,明顯高于對(duì)照。三處理組的PAL酶活變化趨勢(shì)一致,均為先增加后降低,且均于第8天出現(xiàn)活性峰值后急劇下降,第10天后PAL酶活變化相對(duì)趨緩,對(duì)照組的PAL活性變化不大,較為平穩(wěn)。噴施安絡(luò)小皮傘多糖24h后接毒處理組的PAL變化最明顯,峰值最高,為對(duì)照的3.45倍,其次為安絡(luò)小皮傘多糖與等量病毒液混合30min后接種處理組;單獨(dú)噴施安絡(luò)小皮傘多糖處理煙葉酶活變化相對(duì)較小,其峰值顯著低于另兩處理。2.3.3ppo酶活測(cè)定從圖3看出,三處理組的PPO酶活變化較對(duì)照組顯著。單獨(dú)噴施安絡(luò)小皮傘多糖處理組的PPO酶活前階段緩慢升高,直至第10天出現(xiàn)峰值后降低;噴施安絡(luò)小皮傘多糖24h后接毒處理組PPO酶活變化顯著,于第4天出現(xiàn)一個(gè)小高峰后降低,隨后繼續(xù)升高直至第10天出現(xiàn)峰值,為對(duì)照的2.82倍;安絡(luò)小皮傘多糖與等量病毒液混合30min后接種處理組的PPO酶活變化趨勢(shì)與噴施多糖24h后接毒處理組的變化趨勢(shì)相似,但在第12天才出現(xiàn)峰值且低于噴施多糖24h后接毒處理組的峰值。3抗菌活性的變化本研究表明安絡(luò)小皮傘多糖對(duì)CMV有顯著的體外鈍化和預(yù)防效果,噴施安絡(luò)小皮傘多糖200倍液24h后接CMV病毒液,預(yù)防效果可高達(dá)93.15%。安絡(luò)小皮傘多糖不同處理方式及濃度影響其對(duì)CMV的防治效果。植物抗病是一個(gè)多種因素互作的過(guò)程,其中包括木質(zhì)素、植保素、酚類合成和其他病程相關(guān)蛋白合成的相關(guān)因子。過(guò)氧化物酶(POD)在植物機(jī)體防御體系中起重要作用。不僅是重要的內(nèi)源活性氧清除劑,還參與了木質(zhì)素聚合過(guò)程,POD活性升高有利于細(xì)胞壁木質(zhì)化而對(duì)病原菌的侵染和擴(kuò)展有一定的限制作用。PAL是植物苯丙烷類次生代謝途徑關(guān)鍵酶和限速酶,催化苯丙氨酸脫氨基后產(chǎn)生肉桂酸并最終轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素。病菌入侵時(shí),植物細(xì)胞受到刺激后啟動(dòng)PAL系統(tǒng)產(chǎn)生木質(zhì)素并沉積在細(xì)胞壁周?chē)?限制病原物在一定的細(xì)胞范圍內(nèi)而阻止其擴(kuò)散。大量研究結(jié)果表明,PPO能促進(jìn)木質(zhì)素前體酚類化合物