藥物含量測定技術(shù)-儀器分析(藥品質(zhì)量檢測技術(shù)課件)

任務(wù)二：儀器分析法高效液相色譜法高效液相色譜法

1.概述HPLC(highPerformanceLiquidChromatograohy)—高效液相色譜是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段：高性能色譜柱，高精度輸液泵，高靈敏度檢測器……廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域：醫(yī)藥、環(huán)保、石化、生命科學(xué)、食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)等無論在技術(shù)上、理論上，還是在應(yīng)用上仍處于發(fā)展階段。高效液相色譜法

1.概述

HPLC的儀器配置及流程高效液相色譜法

2.原理

高效液相色譜法

2.原理

色譜圖：色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖，其縱坐標(biāo)為信號強度，橫坐標(biāo)為保留時間。高效液相色譜法

3.理論基礎(chǔ)A為渦流擴散項B/u分子擴散項Cu項即傳質(zhì)阻力項高效液相色譜法4.HPLC特點高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便。

經(jīng)典LCHPLC柱之內(nèi)徑1~5cm~0.4cm長度50~100cm15~50cm填充材料粒度150μm~200μm4μm~10μm使用壓力1~10atm50~200atm分離時間0.5h~天~10min高效液相色譜法4.HPLC特點與氣相色譜法比較，HPLC的優(yōu)點1.分析對象廣

氣相色譜只限于分析氣體和沸點較低的化合物；HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適用于高沸點、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)。原則上講，幾乎可以分析除永久氣體外所有的有機和無機化合物。

高效液相色譜法⒉流動相對分離起作用

氣相色譜的流動相僅起運載作用，對組分不產(chǎn)生相互作用力；HPLC的流動相對組分產(chǎn)生相互作用力，相當(dāng)于增加了一個控制和改進分離條件的參數(shù)。⒊經(jīng)常在室溫條件下操作

氣相色譜法一般在較高溫度下進行。缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格。任務(wù)二：儀器分析法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜儀的應(yīng)用1.定性分析方法HPLC的定性分析方法可以分為色譜鑒定法和非色譜鑒定法。非色譜鑒定法又可以分為化學(xué)鑒定法和兩譜聯(lián)用鑒定法。2.定量分析方法HPLC的定量分析方法，有內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、加校正因子的主成分自身對照法、不加校正因子的主成分自身對照法以及峰面積歸一化法等，常用內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法進行定量分析。高效液相色譜法

1.定性分析法

①色譜鑒定法：色譜鑒定法是利用色譜定性參數(shù)保留時間（或保留體積）和相對保留值或用對照法對組分進行鑒別分析。原理是同一物質(zhì)在相同色譜條件下保留時間相同，此法只對范圍已知的化合物進行定性分析。②非色譜鑒定法a化學(xué)鑒定法化學(xué)鑒定法是利用專屬性化學(xué)反應(yīng)對分離后收集的組分進行定性分析。此法只能鑒別組分屬于某一類化合物。通常是收集色譜部分，再與官能團分類試劑反應(yīng)。b兩譜聯(lián)用鑒定法當(dāng)相鄰組分的分離度足夠大時，以制備HPLC獲得純組分，而后用紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振波譜等分析手段進行定性鑒定。高效液相色譜法

2.定量分析方法

①內(nèi)標(biāo)法測定供試品中主成分或某個雜質(zhì)含量：以待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法。使用內(nèi)標(biāo)法可以抵消儀器穩(wěn)定性差、進樣量不夠準(zhǔn)確等原因帶來的定量分析誤差，如果在試樣預(yù)處理前加入內(nèi)標(biāo)物，則可以抵消方法全過程引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法可分為校正曲線法、內(nèi)標(biāo)一點法、內(nèi)標(biāo)二點法及校正因子法等。高效液相色譜法

2.定量分析方法

②外標(biāo)法測定供試品中主成分含量：以對照品的量對比求算試樣含量的方法。對照品在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。外標(biāo)物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求具有一定的純度，分析時外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。外標(biāo)法在操作和計算上可分為校正曲線法和校正因子求算。校正曲線法是用已知不同含量的標(biāo)樣系列等量進樣分析，然后做出響應(yīng)信號與含量之間的關(guān)系曲線，也就是校正曲線。定量分析樣品時，在測校正曲線相同條件下進同等樣量的等測樣品，從色譜圖上測出峰高或峰面積，再從校正曲線查出樣品的含量。校正因子求算法時根據(jù)標(biāo)樣多次分析后得到的響應(yīng)信號與其含量，求出它的絕對校正因子，再根據(jù)公式求出待測樣品中的含量。高效液相色譜法

2.定量分析方法

③加校正因子的主成分自身對照法：測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按下式計算雜質(zhì)的校正因子。校正因子（?）=AsCr/Ar×Cs

式中As——雜質(zhì)對照品的峰面積或峰高

Cr——待測成分對照品的濃度Ar——待測成分對照品的峰面積或峰高?——雜質(zhì)對照品待測成分的濃度高效液相色譜法

2.定量分析方法

④不加校正因子的主成分自身對照法：測定雜質(zhì)含量時，若沒有雜質(zhì)對照品時，也可以采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述加校正因子的主成分自身對照法配制對照溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣。除另有規(guī)定外，前者的記錄時間，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍。測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)含量。高效液相色譜法

2.定量分析方法

⑤峰面積歸一化法：按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。任務(wù)二：儀器分析法氣相色譜法氣相色譜法氣相色譜儀的測定方法

測定方法包括內(nèi)標(biāo)法、外標(biāo)法、峰面積歸一化法以及標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法等。其中前三種測定法的具體內(nèi)容均同高效液相色譜法[?中國藥典?(2010版)附錄VD]項下相應(yīng)的規(guī)定,在此只介紹標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法。氣相色譜法氣相色譜儀的測定方法

標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法：精密稱取某個雜質(zhì)或等測成分對照品適量，配制成適當(dāng)濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入供試品溶液中，根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測定雜質(zhì)或主成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試品溶液中某個雜質(zhì)的主成分含量。氣相色譜法氣相色譜儀的測定方法

也可按式進行計算，加入對照品溶液前后校正因子應(yīng)相同，即：

待測組分的濃度Cx可通過下式進行計算：

式中Cx—供試品中組分X的濃度Ax—供試品中組分X的色譜峰面積ΔCx—所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度Ais—加入對照品后組分X的色譜峰面積氣相色譜法氣相色譜儀的測定方法

由于氣相色譜法的進樣量一般僅數(shù)微升，為減小進樣誤差，尤其當(dāng)采用手工進樣時，由于留針時間和室溫等對進樣量也有影響，故以采用內(nèi)標(biāo)法定量為宜；當(dāng)采用自動進樣器時，由于進樣重復(fù)性的提高，在保證分析誤差的前提下，也可采用外標(biāo)法定量。當(dāng)采用頂空進樣時，由于供試品和對照品處于不完全相同的基質(zhì)中，故可采用標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法與其他定量方法結(jié)果不一致時，應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)加入法結(jié)果為準(zhǔn)。任務(wù)二：儀器分析法氣相色譜法氣相色譜法

1.概述

氣相色譜法系采用氣體為流動相（載氣）流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。氣相色譜具有分辨效能高、供試品用量少、選擇性能好、靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點。氣相色譜主要用于分離測定一些氣體及易揮發(fā)性物質(zhì)，不適用于高沸點、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析。被分離組分的定性較為困難。氣相色譜法

2.原理

氣相色譜分離是利用試樣中各組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配系數(shù)不同，當(dāng)氣化后的試樣被載氣帶入色譜柱中運行時，組分就在其中的兩相間進行反復(fù)多次的分配（吸附—脫附—放出）。由于固定相對各種組分的吸附能力不同，因此各組分在色譜柱中的運行速度就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分離，順序離開色譜柱進入檢測器，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。任務(wù)二：儀器分析法氣相色譜法氣相色譜法固定相

一般來說，宜按照“相似性”原則選擇固定液：分析非極性樣品時用非極性固定液，分析強極性樣品時用極性強的固定液。把固定液涂敷在開管柱的內(nèi)壁，或涂漬在載體上制成填充柱的固定相，均勿太厚。開管柱的固定液的液膜厚度宜為0.2~0.4μm，填充柱的固定液含量宜為3%~10%。載體顆粒約為柱徑的10%，即80~100目較好。在這種情況下，組分在液相中傳質(zhì)快，載體粒度較小而又未增大填充不均勻性，有利于在較低的溫度下分析高沸點組分及縮短分析時間。氣相色譜法流動相

即載氣,可用氦氣、二氧化碳、氫氣、氮氣等。載氣的選擇與純化的要求取決于所用的色譜柱、檢測器和分析項日的要求,如對有些固定相不能與微量氧氣接觸,又如對熱傳導(dǎo)池檢測器宜用氫氣做載氣;對電子捕獲檢測器須除去載氣中負電性較強的雜質(zhì)，以利于提高檢測器的靈敏度。用相對分子質(zhì)量小的氣體作載氣時可用較高的線速，這時柱效下降不大，卻可以縮短分析時間，因為相對分子質(zhì)量小的氣體黏度小，柱壓增加不大，并且在高線速時可減少氣相傳質(zhì)阻力。用氫氣作載氣時，在填充柱和開管柱中的流速可分別選用35mL/min,2mL/min。任務(wù)二：儀器分析法氣相色譜法氣相色譜法

氣相色譜儀結(jié)構(gòu)氣路系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)溫控系統(tǒng)檢測記錄系統(tǒng)氣相色譜法

（1）氣路系統(tǒng)氣相色譜法

（2）進樣系統(tǒng)氣相色譜法（3）分離系統(tǒng)

分離系統(tǒng)由色譜柱組成，它是色譜儀的核心部件，其作用是分離樣品。色譜柱主要有兩類：填充柱和毛細管柱。

1）填充柱填充柱由不銹鋼或玻璃材料制成，內(nèi)裝固定相，一般內(nèi)徑為2～4mm，長1～3m。填充柱的形狀有U型和螺旋型二種。

2）毛細管柱毛細管柱又叫空心柱，分為涂壁，多孔層和涂載體空心柱。涂壁空心柱是將固定液均勻地涂在內(nèi)徑0．l～0.5mm的毛細管內(nèi)壁而成，毛細管材料可以是不銹鋼，玻璃或石英。毛細管色譜柱滲透性好，傳質(zhì)阻力小，而柱子可以做到長幾十米。與填充往相比，其分離效率高（理論塔板數(shù)可達106）、分析速度塊、樣品用量小，但柱容量低、要求檢測器的靈敏度高，并且制備較難。

氣相色譜法（4）溫控系統(tǒng)

在氣相色譜測定中，溫度是重要的指標(biāo)，它直接影響色譜柱的選擇分離、檢測器的靈敏度和穩(wěn)定性?？刂茰囟戎饕笇ιV柱爐，氣化室，檢測器三處的溫度控制。色譜柱的溫度控制方式有恒溫和程序升溫二種。對于沸點范圍很寬的混合物，往往采用程序升溫法進行分析。程序升溫指在一個分析周期內(nèi)柱溫隨時間由低溫向高溫作線性或非線性變化，以達到用最短時間獲得最佳分離的目的。氣相色譜法（5）檢測記錄系統(tǒng)這個系統(tǒng)是指樣品經(jīng)色譜柱分離后，各成分按保留時間不同，順序地隨載氣進人檢測器檢測器把進入的組分按時間及其濃度或質(zhì)量的變化，轉(zhuǎn)化成易于測量的電信號，經(jīng)過必要的放大傳遞給記錄儀或計算機，最后得到該混合樣品的色譜流出曲線及定性和定量信息。任務(wù)二：儀器分析法紫外——可見分光光度法紫外—可見分光光度法

1.概述

分光光度法是基于被測物質(zhì)的分子對光具有選擇吸收的特性而建立的分析方法。根據(jù)測定時所選用的光源

紫外分光光度法可見分光光度法紅外分光光度法紫外—可見分光光度法

1.概述

紫外-可見吸收光譜：分子中價電子能級躍遷。波長范圍：200-760nm(1)紫外光區(qū):200-400nm，可用于物質(zhì)的定性和定量分析。(2)可見光區(qū):400-760nm，可用于有色物質(zhì)的定性和定量分析。二者合成紫外—可見分光光度法，即UV-Vis。紫外—可見分光光度法

2.原理

紫400紅660橙600黃560綠530藍綠500綠藍450藍420紫外—可見分光光度法

2.原理溶液的顏色：是由于它選擇性地吸收了一部分光，而呈現(xiàn)它的補色。例如：三(鄰二氮菲)合鐵配合物溶液吸收了508nm處的光，而呈現(xiàn)紫紅色。光的互補：若兩種不同顏色的單色光按一定的強度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補色的光。紫外—可見分光光度法

2.原理

將某物質(zhì)的溶液，用不同波長的單色光作入射光，測定這一溶液吸光度A。每種波長的單色光都有其相對應(yīng)的吸光度。然后以A為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)作圖，所得曲線即為該溶液的吸收光譜。

max=515

A480520560nm紫外—可見分光光度法

2.原理光吸收的基本定律Lambert-Beer定律A=lg(1/T)=Kbc