林木重要性狀相關(guān)基因的分離與鑒定

林木重要性狀相關(guān)基因的分離與鑒定

該樹在凈化大氣、防止風(fēng)和沙、保持水土、保持生態(tài)平衡和生物多樣性、優(yōu)質(zhì)木材和優(yōu)質(zhì)林地方面發(fā)揮著重要作用。它具有顯著的生態(tài)效應(yīng)、社會(huì)效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。傳統(tǒng)的育種手段如引種馴化、雜交育種、選擇育種等難以實(shí)現(xiàn)林木高抗優(yōu)質(zhì)多性狀綜合改良的需求。近年來生物技術(shù)的發(fā)展、分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的運(yùn)用以及基因工程研究的興起,為利用基因工程手段改良林木、加速林木新品種的選育奠定了基礎(chǔ)。林木等木本植物基因資源豐富,遺傳多樣性復(fù)雜,但許多天然優(yōu)良基因尚未被分離利用,大部分基因的功能仍處于未知狀態(tài)。各種模式植物基因組測(cè)序的完成,特別是楊樹基因組測(cè)序計(jì)劃的完成,并結(jié)合連鎖和連鎖不平衡的分析方法,大大促進(jìn)了木本植物功能基因的克隆和功能基因組學(xué)的研究(尹佟明2010)。近年來,林木功能基因陸續(xù)被分離和鑒定。Yamamoto等(1988a)從黑松(Pinusthunbergii)中克隆了首個(gè)來自林木的基因——核酮糖二磷酸羧化酶基因。到目前為止,為達(dá)到改良材性、縮短花期、抗干旱和病蟲害等育種目標(biāo),科研人員分離的林木來源的基因總數(shù)達(dá)到470個(gè)以上,運(yùn)用到的克隆技術(shù)主要有:RACE技術(shù)、RT-PCR技術(shù)、mRNA差別顯示技術(shù)(DDRT-PCR)、抑制性差減雜交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)、核酸探針分離目標(biāo)基因和酵母單雜交技術(shù)等。對(duì)這些基因的分析鑒定,主要采用與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)等的同源基因進(jìn)行相似性比較,構(gòu)建分子進(jìn)化樹,或?qū)Φ鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能進(jìn)行預(yù)測(cè)分析;通過半定量和定量RT-PCR技術(shù),研究目的基因在某種時(shí)空狀態(tài)或脅迫環(huán)境下的表達(dá)量。運(yùn)用反向遺傳學(xué)方法,通過基因超量表達(dá)技術(shù)、反義RNA技術(shù)、RNA干涉和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究林木基因的功能,填補(bǔ)或完善基因功能注釋,闡述多年生林木生物學(xué)性狀的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制正成為當(dāng)前林木基因克隆及應(yīng)用研究的熱點(diǎn)。本文綜述了近20年來國內(nèi)外林木基因克隆的研究進(jìn)展,并對(duì)今后該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。1功能基因序列近幾年國外在林木的木材形成調(diào)控和花發(fā)育機(jī)制、抗旱耐鹽和抗氧化脅迫等方面做了大量研究,從楊樹、松樹、桉樹、柳樹、檉柳(Tamarixchinensis)、白樺(Betulaplatyphylla)和銀杏(Ginkgobiloba)等植物中克隆獲得了387個(gè)功能基因,其中參與木材形成的有87個(gè),花發(fā)育49個(gè),抗凍21個(gè),抗旱9個(gè),抗病9個(gè),抗蟲3個(gè),防御機(jī)械損傷3個(gè),抗氧化7個(gè),耐重金屬污染5個(gè)及其它功能的基因194個(gè)。上述各基因及其功能詳見表1和表2。1.1轉(zhuǎn)錄因子pta基因?qū)S管組織的影響木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因PtCOMT、F5H、4CL、CCR、CCoAOMT和CAD等均已從毛果楊(Populustrichocarpa)、美洲山楊(Populustremuloides)、火炬松(Pinustaeda)中克隆(Doorsselaereetal.,1995;Huetal.,1998;Lietal.,1999,2005;Siboutetal.,2002;BhuiyaandLiu,2009)。利用基因工程技術(shù)對(duì)這些基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控,可以有效改變木質(zhì)素組成或降低木質(zhì)素含量,培育新型能源品種,從源頭降低造紙成本,減少環(huán)境污染(高原等,2007)。除此以外,Ko等(2005)從歐洲山楊×毛白楊雜交楊(Populustremula×Populustomentosa)中克隆到classIIIHD-Zip轉(zhuǎn)錄因子PtaHB1基因,該基因被證實(shí)在維管組織分化中起調(diào)控作用。Samuga和Joshi(2004)從美洲山楊中分離到PtrCSLD2全長基因,其在木質(zhì)部次級(jí)細(xì)胞壁有較高豐度的表達(dá),參與纖維素生物合成。PoptrMP1和PoptrMP2屬于MONOPTEROS(MP)/AUXIN響應(yīng)因子,PoptrMP1集中在毛果楊次生木質(zhì)部表達(dá),過量表達(dá)PoptrMP1導(dǎo)致作用的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄量提高2–4倍,兩者可能在維管組織的發(fā)育中起作用(JohnsonandDouglas,2007)。Sonoda等(2009)將赤桉(Eucalyptuscamald-ulensis)HD-ZipclassII轉(zhuǎn)錄因子EcHB1基因轉(zhuǎn)入煙草,轉(zhuǎn)基因植株纖維長度和干重增加,葉片、根部和莖部的生長量均明顯高于對(duì)照。Lee等(2009)的研究證明,RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制PoGT47C的表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因銀白楊×歐洲山楊雜交楊(Populusalba×Populustremula)植株次生細(xì)胞壁厚度明顯減小,葡糖醛酸木聚糖的合成受阻,導(dǎo)管外觀變形,纖維素含量下降。最近,MYB轉(zhuǎn)錄因子PtrMYB3和Ptr-MYB20及NAC轉(zhuǎn)錄因子PtrWND2B和PtrWND6B均被證實(shí)參與纖維素和木質(zhì)素的生物合成,并參與調(diào)控木材形成(McCarthyetal.,2010;Zhongetal.,2010)。1.2輻射松的ptm3/4基因林木樹種存在生長周期長、生殖發(fā)育滯后的特點(diǎn)。目前已從美洲山楊、輻射松(Pinusradiata)和巨桉(Eucalyptusgrandis)中分離了一些參與花形成和發(fā)育的基因——MYB、PTM、PMADS2、PTLF、PRFLL、NEEDLY、FT2,為通過基因工程手段進(jìn)行開花調(diào)控,縮短花周期,獲得提早開花或花期不育的轉(zhuǎn)基因新品種打下良好基礎(chǔ)(Mellerowiczetal.,1998;Mouradovetal.,1998;Rottmannetal.,2000;Csekeetal.,2003a,2003b;Liuetal.,2003;Hsuetal.,2006;Mellwayetal.,2009)?；òl(fā)育基因PTM3/4為美洲山楊SEPALLATA-classMADS-box基因,其在轉(zhuǎn)基因煙草、擬南芥、美洲山楊中均參與季節(jié)性的開花調(diào)節(jié)(Csekeetal.,2005)。輻射松的NEEDLY(NLY)基因與擬南芥LEAFY/FLORICAULA基因高度同源,轉(zhuǎn)基因LFY::NLY植株可以互補(bǔ)花發(fā)育途徑中對(duì)應(yīng)基因LFY的缺失,表明NLY與LFY在功能上具有相似性(Mouradovetal.,1998)。Dornelas和Rodriguez(2006)運(yùn)用Northern雜交和原位雜交技術(shù)研究了雪松(Cedrusdeodara)FLORICAULA/LEAFY同源基因CfLFY的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)CfLFY集中在花分生組織和花芽中表達(dá),參與了雪松的開花調(diào)控。1.3天幕毛蟲基因訴訟將抗蟲基因引入樹木細(xì)胞并使其在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地遺傳和表達(dá),使林木樹種獲得對(duì)昆蟲的抗性,成為樹木抗蟲育種的一種新手段。林業(yè)上應(yīng)用較為普遍的抗蟲基因,常見的有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑PI基因和昆蟲神經(jīng)蝎毒素AaIT基因等,部分抗蟲轉(zhuǎn)基因林木進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)后不可避免地存在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)等問題。林木自身同樣具備抗蟲基因資源,近年從喜樹(Camptothecaacuminata)、毛果楊×美洲黑楊雜交楊(Populustrichocarpa×Populusdeltoides)中分離的TDC、win3等基因顯示出抗蟲功能。López-Meyer和Nessler(1997)將喜樹的色氨酸脫羧酶基因TDC轉(zhuǎn)化到歐洲山楊×銀白楊雜交楊(Populustremula×Populusalba)中,過量表達(dá)TDC(35S::TDC)的轉(zhuǎn)基因植株葉片色胺積累,對(duì)天幕毛蟲的侵害起到很好的阻抑作用。win3的編碼產(chǎn)物與豆莢種子Kunitz型胰蛋白酶抑制劑有很高的相似性,可能是一種胰蛋白酶抑制劑基因,能夠抑制害蟲胰蛋白酶原的激活或胰臟中其它蛋白酶原的活化,干擾害蟲的消化吸收,起到防治害蟲的目的(Bradshawetal.,1989)。林木病害的病原菌種類多,變異速度快,分離、純化工作不易進(jìn)行。以前樹木病害的研究主要集中在抗病QTL與抗病質(zhì)量性狀定位,以及抗病基因相似序列的克隆與鑒定方面。轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究主要利用外源的病毒外殼蛋白基因CP、幾丁質(zhì)酶基因Chi和抗菌肽基因LCI等,導(dǎo)入目標(biāo)樹種中,以提高林木的抗病性。近年來從樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、加州山松(Pinusmonticola)和火炬松中克隆了PsDef1、PmCh4A、PtTPS-LAS和PtAO等抗病毒基因,大大促進(jìn)了林木抗病基因工程的研究進(jìn)程。Kovalyova等(2007)從樟子松中分離獲得了長度為252bp的防御素基因PsDef1,其具有廣譜、高效的抗微生物活性。幾丁質(zhì)酶是植物抗真菌酶,外源茉莉酮酸、蛋白磷酸酶1A、2A抑制劑處理和機(jī)械損傷均導(dǎo)致加州山松中PmCh4A蛋白的積累增加,顯示了幾丁質(zhì)酶基因PmCh4A在防御皰銹病和非生物脅迫方面的重要作用(Liuetal.,2005)。Ro和Bohlmann(2006)從火炬松中分離了PtTPS-LAS基因,其編碼二萜合酶。二萜合酶是二萜醌類化合物生物合成的一個(gè)關(guān)鍵酶。萜類化合物具有抑制真菌活性的作用,可以避免林木受到真菌感染。1.4鹽脅迫對(duì)植物抗氧化酶系統(tǒng)的影響在干旱脅迫下林木自身的調(diào)控基因和功能基因均被誘導(dǎo)表達(dá)。調(diào)控基因編碼DREB、MYB/MYC和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子,它們與響應(yīng)水分脅迫的順式作用元件相結(jié)合,從而激活下游基因表達(dá)。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)——蔗糖、脯氨酸、水通道蛋白和LEA蛋白等屬于功能性基因的表達(dá)產(chǎn)物,可直接參與減輕干旱脅迫所造成的危害。干旱脅迫應(yīng)答基因編碼蛋白——LEA蛋白是一類重要的脫水素,具有高度親水性,能夠保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫的傷害。歐洲櫟(Quercusrobur)和歐美楊(Populuseuramericana‘Dorskamp’)的脫水素基因QrDhn1、QrDhn2、QrDhn3、peudhn1均能夠響應(yīng)外部缺水條件,其表達(dá)量明顯提高,具有增強(qiáng)植物脫水耐性的功能(Carusoetal.,2002;?underlíkováetal.,2009a)。Mayne等(1997)報(bào)道了加拿大短葉松(Pinusbanksiana)干旱誘導(dǎo)基因JPD16和JPD18,在外源10λmol·m–3ABA作用1小時(shí)后,其在植株根和針葉部的表達(dá)量明顯上升。Chang等(1996a)從遭受水分脅迫的火炬松根部cDNA文庫中分離到pLP5,該基因可能編碼細(xì)胞壁增厚蛋白,防止植株脫水萎蔫。歐洲水青岡(Fagussylvatica)ABA響應(yīng)基因FsDhn1編碼晚期胚胎富集蛋白LEA,在歐洲水青岡種子干燥的條件下,LEA蛋白受誘導(dǎo)特異表達(dá),表明FsDhn1是一個(gè)干旱誘導(dǎo)基因(Jiménezetal.,2008)。喜樹CaAOC基因受鹽環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá),原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)化子能在400mmol·L–1NaCl的高鹽培養(yǎng)基中正常生長,且鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量明顯高于對(duì)照(Pietal.,2009)。植物適應(yīng)低溫反應(yīng)的產(chǎn)生有依賴ABA和非依賴ABA兩種途徑。前者包括ABA應(yīng)答元件和帶有bzip基序的ABA應(yīng)答元件結(jié)合蛋白;后者包括CRT/DRE順式作用元件和CBF結(jié)合蛋白(CRT/DRE-bindingfactor)等重要構(gòu)件。Kayal等(2006)從岡尼桉(Eucalyptusgunnii)分離的冷誘導(dǎo)基因EguCBF1a和EguCBF1b,編碼CRT/DRE結(jié)合因子,能夠響應(yīng)短日照和低溫脅迫。Puhakainen等(2004)從白樺中克隆獲得低溫誘導(dǎo)基因Bplti36,并發(fā)現(xiàn)在短日照和低溫處理下,Bplti36轉(zhuǎn)錄水平顯著上升。白樺脂肪酸生物合成基因BpFAD3、BpFAD7和BpFAD8,參與亞油酸(18:2)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?亞麻酸(18:3)的過程;低溫能誘導(dǎo)BpFAD3和BpFAD8的表達(dá),但抑制BpFAD7的表達(dá),使α-亞麻酸(18:3)含量增高,脂肪酸不飽和性增加,從而提高白樺的抗寒能力(Martzetal.,2006)。逆境脅迫下植物的抗氧化系統(tǒng)主要由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物組成,它們協(xié)同作用抵抗活性氧對(duì)植物機(jī)體的傷害。其中關(guān)鍵的抗氧化酶基因——銅/鋅超氧化物歧化酶基因PtSodCcl,由Akkapeddi等(1999)從臭氧脅迫的美洲山楊葉片基因組中克隆,Northern雜交結(jié)果顯示,PtSodCcl對(duì)臭氧誘導(dǎo)敏感,其表達(dá)量迅速上升,推測(cè)其能夠清除臭氧的脅迫毒害。夜叉榿木(Alnusfirma)血紅素Hb基因AfHb1受NO誘導(dǎo),促使NO清除劑的產(chǎn)生,從而降低NO脅迫對(duì)機(jī)體的損害(Sasakuraetal.,2006)。此外,Sillanp??等(2005)的研究認(rèn)為,半胱氨酸蛋白酶基因Cyp1和Cyp2參與白樺葉片衰老的調(diào)控,是一種重要的抗氧化物質(zhì)。當(dāng)今環(huán)境污染日趨嚴(yán)重,樹木自身具備一定的修復(fù)功能,對(duì)維持生態(tài)平衡和抵抗環(huán)境惡化具有重要作用。近年來,基因工程技術(shù)逐漸成為對(duì)被污染環(huán)境進(jìn)行生物治理的有力工具。從楊樹中分離的PtdMTP1、白樺的MRP4等基因及其應(yīng)用,對(duì)于闡明樹木抗環(huán)境污染的機(jī)制有重要意義。PtdMTP1基因從毛果楊×美洲黑楊雜交楊中克隆得到,具有解除Cd和Zn脅迫的能力,并對(duì)抑制Co、Mn和Ni等重金屬的富集有一定效果(Blaudezetal.,2003)。Keinanen等(2007)運(yùn)用抑制消減雜交(SSH)技術(shù)從Cu脅迫的白樺中獲得耐重金屬基因MRP4,其在根與芽部的表達(dá)量顯著上升,參與消除重金屬Cu對(duì)生物的毒性。2林木基質(zhì)基因的轉(zhuǎn)化我國自20世紀(jì)80年代末期開始林木轉(zhuǎn)基因的研究主要采用葉盤法和基因槍等轉(zhuǎn)化方法,將農(nóng)作物或細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)化至林木基因組中。利用林木基因進(jìn)行遺傳改良雖然起步較晚,但發(fā)展迅速,已獲得具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新基因80多個(gè),其中參與木材形成的有15個(gè),花發(fā)育7個(gè),抗凍4個(gè),抗旱15個(gè),抗病2個(gè)抗蟲2個(gè),抗氧化1個(gè),耐重金屬污染3個(gè),其它功能基因35個(gè)。上述各基因及其功能詳見表1和表2。2.1其他化學(xué)成分參與細(xì)胞的分化和基因表達(dá)國內(nèi)科研人員從歐美楊107(Populusxeuramericana‘74/76’)、毛白楊(Populustomentosa)、尾葉桉(Eucalyptusurophylla)中分離克隆了PAL、CCoAOMT、4CL、C3H及COMT等參與木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵基因,為利用基因工程調(diào)控林木木質(zhì)素的研究奠定了基礎(chǔ)(魏建華等,2001a,2001b;薛永常等,2004;孔華等,2008;聶會(huì)忠和薛永常,2008)。另外,Li等(2009)的研究認(rèn)為,細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因CDKB和CYCB參與毛白楊形成層細(xì)胞分裂。擴(kuò)展蛋白expansin是植物細(xì)胞壁松弛因子。張春玲等(2006)利用RT-PCR從毛白楊樹干形成層部位克隆了編碼該蛋白的PtEXP1基因,PtEXP1可能參與形成層細(xì)胞向木質(zhì)部細(xì)胞的分化。歐陽昆唏等(2010)采用RACE技術(shù),以團(tuán)花樹(Anthocephaluschinensis)枝條形成層的cDNA為模板,克隆得到擴(kuò)展蛋白全長基因AcEXP1。李春秀等(2007)從毛白楊中克隆獲得長度為3215bp的纖維素合成酶基因PtoCesA1;35S::PtoCesA1轉(zhuǎn)基因煙草株系生長受到抑制,其基部木質(zhì)部厚度比對(duì)照植株和野生型植株小,纖維細(xì)胞壁厚度也有所減小,表現(xiàn)出反義抑制的表型,可能發(fā)生了轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)現(xiàn)象。賀郭等(2010)根據(jù)毛果楊NAC068基因設(shè)計(jì)引物,從毛白楊基因組中克隆得到該基因5’側(cè)翼區(qū)901bp長的片段pProNAC068;該啟動(dòng)子介導(dǎo)的GUS活性檢測(cè)表明,其在形成層區(qū)域啟動(dòng)表達(dá)的強(qiáng)度比35S啟動(dòng)子的高。2.2花芽方面的基因表達(dá)培育不育的轉(zhuǎn)基因林木新品種可以有效減少轉(zhuǎn)基因花粉引起的基因逃逸。例如王冬梅等(2005)構(gòu)建了毛白楊PtAP3基因的正反義表達(dá)載體,并獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株,下一步將開展毛白楊的遺傳轉(zhuǎn)化工作,以期實(shí)現(xiàn)干擾毛白楊等樹種的開花,使花器官敗育,從而控制毛白楊飛絮污染。PtAP3具有高度保守的MADS-box區(qū),在毛白楊花發(fā)育調(diào)控過程中作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。蘇曉華等(2009)從美洲黑楊(Populusdeltoides)雄性花芽cDNA文庫中分離得到MADS-box基因PdPI,其在花蕾的表達(dá)量明顯高于其它各組織部位;轉(zhuǎn)基因研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)正義PdPI基因的煙草植株提前開花,而轉(zhuǎn)反義基因的植株與對(duì)照相比無明顯差異。PdPI在花蕾、雄花序的花被和花藥中表達(dá)量高,在花梗和成熟花粉中的表達(dá)量低,與花器官的發(fā)育和開花調(diào)控密切相關(guān)(Zhangetal.,2008a)。安新民等(2010)從毛白楊花芽中克隆了PtLFYcDNA序列,其在雌雄花芽發(fā)育過程中的差異表達(dá)表明PtLFY參與花芽的形態(tài)分化。GinNdly是花分生組織基因LEAFY的同源基因。張建業(yè)等(2005)利用銀杏GinNdly基因構(gòu)建了正義與反義植物表達(dá)載體,轉(zhuǎn)基因的研究還在進(jìn)行當(dāng)中。2.3．體制型基因病毒、真菌和細(xì)菌有著多變的致病機(jī)制,由它們引起的林木病害相當(dāng)嚴(yán)重,每年因森林病蟲害造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元。相比農(nóng)作物,樹木抗病基因的研究較缺乏,目前國內(nèi)克隆的抗病基因僅有PtDRG01和dir。李琰等(2008)構(gòu)建了NBS型抗病基因PtDRG01的原核表達(dá)載體,導(dǎo)入大腸桿菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得目標(biāo)長度的特異表達(dá)蛋白,為下一步的蛋白功能研究奠定了基礎(chǔ)。李海霞等(2009)將毛白楊的PtDRG01基因?qū)霟煵?轉(zhuǎn)基因煙草株系TG-11葉片中的煙草花葉病毒(TMV)數(shù)量顯著少于非轉(zhuǎn)基因植株,表明PtDRG01基因具有抗病毒功能。高彩球等(2006)通過構(gòu)建檉柳cDNA文庫,挑取單克隆測(cè)序獲得dir基因的cDNA全長序列;dir基因編碼產(chǎn)物參與木質(zhì)素的合成,與檉柳的病菌防御有關(guān)。天牛可對(duì)多種林木造成危害,楊樹、柳樹、槐樹等均受其直接威脅,林區(qū)受害面積大,造成的經(jīng)濟(jì)損失慘重。對(duì)此,相關(guān)專家開展了一系列研究。張星耀等(2007)將來源于河北毛白楊形成層的巰基蛋白酶抑制劑基因CPI,轉(zhuǎn)入到天牛易感樹種中,直接影響天牛的取食和消化,甚至殺死害蟲。win3基因編碼產(chǎn)物類似白薯或豆類胰蛋白酶抑制劑,李強(qiáng)等(1999)從歐洲黑楊(Populusnigra)和美洲黑楊中擴(kuò)增出win3基因啟動(dòng)子WINP和WIDP,兩者分別控制的GUS基因表達(dá)具有因傷誘導(dǎo)的效應(yīng)。梁文星等(2006)運(yùn)用RT-PCR方法從新疆楊(Populusalbavar.pyramidalis)葉片中克隆到1個(gè)損傷誘導(dǎo)型Kunitz胰蛋白酶抑制劑基因PaTI1。原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,純化后的融合蛋白對(duì)胰蛋白酶的活性有抑制作用,每8.5μg融合蛋白可完全抑制1μg牛胰蛋白酶的活性,可有效減弱或阻斷蛋白酶對(duì)外源蛋白質(zhì)的水解作用。2.4選育抗凍基因的手段冷適應(yīng)蛋白是低溫誘導(dǎo)表達(dá)的一類特殊蛋白質(zhì)。林士杰等(2006)從檉柳cDNA文庫中分離得到冷適應(yīng)蛋白基因ThCAP片段,并應(yīng)用RACE技術(shù)獲得其全長cDNA序列。Guo等(2009)在進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因研究中,獲得轉(zhuǎn)基因(35S::ThCAP)山新楊(Populusdavidiana×Populusbolleana),轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫的抵抗能力明顯增強(qiáng),證實(shí)ThCAP是一個(gè)重要的耐寒基因。甜楊(Populussuaveolens)冷誘導(dǎo)基因ICE1的編碼產(chǎn)物ICE,是在低溫時(shí)誘導(dǎo)抗凍因子CBF家族表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子,可特異性結(jié)合CBF3啟動(dòng)子的MYC作用元件,啟動(dòng)CBF3基因的表達(dá);然后CBF3轉(zhuǎn)錄激活因子再結(jié)合到其下游目的基因啟動(dòng)子的DRE/CRT序列上,誘導(dǎo)抗凍基因COR的表達(dá),從而提高植株的抗凍性(林元震等,2007)。Lin等(2005)對(duì)甜楊PsG6PDH基因的原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,受1mmol·L–1IPTG誘導(dǎo)4小時(shí),融合蛋白具有可溶性,且沒有向細(xì)胞外分泌,表明該基因在維持細(xì)胞滲透勢(shì)、參與抗凍脅迫中起重要作用。我國西部和北部的廣闊區(qū)域長期面臨嚴(yán)重的缺水威脅。如何從林木自身分離優(yōu)良抗旱基因,用于抗旱耐鹽節(jié)水新品種的培育,解決西部和北部干旱半干旱地區(qū)大面積造林問題,已成為當(dāng)前需要完成的重大課題。國內(nèi)專家對(duì)此展開了一系列研究。Chen等(2009)從旱生樹種胡楊(Populuseuphratica)中分離到脫水響應(yīng)結(jié)合元件PeDREB2,轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鹽生環(huán)境的適應(yīng)性得到改善,同時(shí)其生長沒有受到影響。Wang等(2009a)從白樺cDNA文庫中克隆了編碼區(qū)長度為750bp的抗壞血酸過氧化物酶APX基因,熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示,在鹽脅迫狀態(tài)下,APX被高豐度誘導(dǎo)表達(dá),可能參與白樺的抗鹽機(jī)制。張守攻等(2006)將小葉楊(Populussimonii)膽堿單氧化物酶基因CMO整合至雜種落葉松(Larixleptolepis×L.olgensis)基因組中,基因表達(dá)和功能檢測(cè)證實(shí),雜種落葉松的抗旱能力得到了明顯的提高。這些研究對(duì)闡明林木抗旱或耐鹽機(jī)制,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因林木抗旱新品系的選育有重要價(jià)值。在遭遇環(huán)境脅迫時(shí),樹木依賴抗氧化防御系統(tǒng),防止膜脂過氧化作用和清除超氧陰離子的攻擊,從而保護(hù)植株自身免受活性氧的傷害。王丙鋒等(2007)利用RACE技術(shù)從檉柳中獲得MnSOD的cDNA全長序列,轉(zhuǎn)化至酵母基因組后,重組酵母的抗干旱、抗高溫能力均明顯高于對(duì)照非重組酵母。重金屬是造成土壤和水系統(tǒng)污染的重要因素,利用林木對(duì)重金屬進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)運(yùn),能有效降低土壤重金屬的含量,達(dá)到環(huán)境修復(fù)的目的。張艷等(2007a)將檉柳的金屬硫蛋白基因MT2連入載體pROKII,抗性實(shí)驗(yàn)證明,轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)Cd2+的抗性顯著提高。另外,將檉柳金屬硫蛋白基因MT1導(dǎo)入煙草,發(fā)現(xiàn)在含有200μmol·L–1和400μmol·L–1Cd2+的MS培養(yǎng)基上,過量表達(dá)MT1轉(zhuǎn)基因煙草的株高和鮮重均明顯優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?且葉綠素含量和SOD活性明顯增加,表明MT1是一個(gè)介導(dǎo)Cd2+脅迫抗性的優(yōu)良基因(張艷等,2007b)。3基因克隆及應(yīng)用趨勢(shì)目前,由于對(duì)不同樹種遺傳背景的了解程度有差異,因此需要選擇性地采取不同克隆方法和策略。如果已知目的基因的全部或部分序列,可通過電子克隆、RACE或染色體步移技術(shù)分離基因全長。也可以針對(duì)已知目的蛋白的某些氨基酸信息,設(shè)計(jì)合適的寡核苷酸探針(庫),通過與含該基因信息的基因組文庫或cDNA文庫雜交,分離編碼此蛋白的DNA序列或cDNA片段;或設(shè)計(jì)目的蛋白的特異抗體與靶蛋白專一結(jié)合,從基因表達(dá)文庫中分離目的蛋白基因。對(duì)于不同組織、器官中不同脅迫狀態(tài)下差異性表達(dá)的基因,可以選用差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR(DDRT-PCR)、RNA指紋技術(shù)(RAP-PCR)和外顯子捕獲等克隆方法。當(dāng)目標(biāo)基因的時(shí)空表達(dá)沒有差異,或沒有任何表達(dá)功能信息時(shí),常采用構(gòu)建文庫直接測(cè)序、圖位克隆法或轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法等實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的克隆?？傮w上看,林木材質(zhì)形成、開花調(diào)控和抗旱相關(guān)的基因克隆研究有一定基礎(chǔ),但抗凍、抗病蟲害、抗環(huán)境污染等方面的研究還很薄弱。我國林木資源雖然豐富,但缺少對(duì)速生、優(yōu)質(zhì)、抗逆等優(yōu)良特性的鄉(xiāng)土樹種的發(fā)現(xiàn)和挖掘,這直接造成了與林木優(yōu)質(zhì)高抗相關(guān)的主效基因的匱乏。已經(jīng)克隆獲得的林木抗逆功能基因,沒有迅速有效地進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化并加以利用。另外,基因克隆的方法單一,絕大部分目標(biāo)基因的分離僅限于RT-PCR和RACE技術(shù),高效實(shí)用的新方法如TAIL-PCR、MOPAC、cDNA捕捉法等并未得到廣泛應(yīng)用。此外,在克隆策略的選擇上針對(duì)性不強(qiáng),盲目地進(jìn)行目標(biāo)基因的大通量分離,反而容易事倍功半。目前,林木轉(zhuǎn)基因主要采用農(nóng)桿菌侵染法和基因槍法。前者易發(fā)生單拷貝或低拷貝的轉(zhuǎn)化事件,而且不適于銀杏、杉木、松柏類等樹種的遺傳轉(zhuǎn)化;后者的轉(zhuǎn)化效率同樣不高,且轟擊過程中可能造成外源基因的斷裂,導(dǎo)致插入基因失活。目前報(bào)道的轉(zhuǎn)基因手段還難以做到將轉(zhuǎn)入的基因定點(diǎn)、定量地整合到宿主基因組中。在植物表達(dá)載體的構(gòu)建中,大多數(shù)使用CaMV35S組成型啟動(dòng)子,對(duì)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或組織特異型啟動(dòng)子欠缺考慮。外源基因?qū)胫参锛?xì)胞后,插入到不同的染色體,整合到不同的DNA區(qū)段(整合位點(diǎn)),而且整合的拷貝數(shù)和次數(shù)也有不同。發(fā)生整合的基因是否具有完整性及是否影響到整合位點(diǎn)的DNA結(jié)構(gòu),在林木中是否同樣遵循孟德爾遺傳規(guī)律,以及外源基因在林木子代中傳遞的穩(wěn)定性等,這些都可能直接影響外源基因功能的鑒定和驗(yàn)證。利用基因工程技術(shù)對(duì)林木進(jìn)行改良,雖然已取得飛速的發(fā)展,并展現(xiàn)著誘人的發(fā)展前景,但不能因此取代常規(guī)育種,新種質(zhì)的創(chuàng)造、新品種的選育有賴于兩者的有機(jī)結(jié)合。針對(duì)林木本身的特點(diǎn)和研究現(xiàn)狀,我們認(rèn)為今后在林木基因克隆及應(yīng)用方面需加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的研究。(1)選擇更新更強(qiáng)的組織特異型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,控制轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)量、表達(dá)時(shí)間和表達(dá)部位。在木材發(fā)育研究中,利用林木中分離的PAL、CAD、CCoAOMT、4CL、pProNAC068等維管組織特異啟動(dòng)子代替35S啟動(dòng)子,驅(qū)使靶基因特異性地在維管組織中表達(dá),可以避免持續(xù)、高效表達(dá)造成的能量損耗和轉(zhuǎn)基因安全性問題(Feuilletetal.,1995;Gray-Mitsumuneetal.,1999;Chenetal.,2000;Luetal.,2004;Bedonetal.,2009;賀郭等,2010)。另外利用抗逆(如抗病)相關(guān)順式作用元件人工構(gòu)建理想啟動(dòng)子,在農(nóng)作物抗病研究中已開始起步(GurrandRushton,2005),在林業(yè)中未見相關(guān)報(bào)道。(2)通過正向遺傳學(xué)方法,構(gòu)建林木例如模式樹種楊樹的突變體庫(張勇等,2006),分離主效基因。利用基因捕獲、T-DNA標(biāo)簽(農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入)、轉(zhuǎn)座子插入、RNAi、基因敲除等手段構(gòu)建楊樹基因突變體庫,造成單個(gè)基因或基因家族的功能抑制、缺失或激活。根據(jù)單株表型鑒別、理化和材性分析等手段,鑒定和克隆關(guān)鍵的主效基因。在后續(xù)的研究中可以開展基因的功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn),以進(jìn)一步驗(yàn)證目標(biāo)基因的功能。目前,擬南芥突變體誘導(dǎo)和大規(guī)模的突變體庫篩選已實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化。國外正有效地開展樹木突變體庫的研究,國內(nèi)對(duì)此的關(guān)注度不太高,因此需要在該領(lǐng)域加強(qiáng)研究。(3)選擇新的克隆方法?；诒磉_(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetag,EST)方法的基礎(chǔ),近幾年基因表達(dá)系列分析技術(shù)(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)得到了發(fā)展和完善,能夠分離差異表達(dá)的基因,并對(duì)上千個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析,并在火炬松木質(zhì)部軸向梯度發(fā)育的差異基因表達(dá)研究中得到應(yīng)用(LorenzandDean,2002)。靶向克隆法是一種新的基因克隆方法,其使用新開發(fā)的靶向克隆酶LPRecco,能夠使末端序列相同的雙鏈DNA(14–18bp)同源重組,從而達(dá)到連接克隆基因和載體的目的(俞遠(yuǎn)東等,2009)?；虮磉_(dá)指紋圖譜(geneexpressionfingerprinting,GEF)利用含有標(biāo)記末端的片段經(jīng)凝膠電泳后構(gòu)成的mRNA指紋圖譜,分析不同細(xì)胞間的指紋圖譜從而得到差異表達(dá)的序列(IvanovaandBelyavsky,1995)。另外,cDNA3′端限制酶切片段顯示(restrictionfragmentdisplay,RFD)技術(shù)、分子指數(shù)的RNA指紋技術(shù)和標(biāo)簽接頭競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)(ATAC-PCR)等在人類、酵母、作物等的基因克隆和表達(dá)研究中有一定的應(yīng)用(PrasharandWeissman,1996;Kato,1996,1997)。這些較新的克隆方法可以試探性地用于林木基因的分離和表達(dá)研究中。(4)導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子基因,提高抗逆性。一個(gè)抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因可以調(diào)控下游一批與抗逆相關(guān)的功能基因的表達(dá)。在這方面對(duì)于農(nóng)作物的研究已進(jìn)行得比較深入,DREB、CBF、ERF等優(yōu)良的轉(zhuǎn)錄因子基因已實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化(Itoetal.,2006;Chenetal.,2007Tangetal.,2007)。林木中雖然克隆了EguCBF1a、EguCBF1b、ICE1、PaDREB2、AP2/ERF、PhCBF4a和PhCBF4b等抗逆轉(zhuǎn)錄因子基因(家族)(Nanjoetal.2004;Qinetal.,2005;Kayaletal.,2006;林元震等2007;Wangetal.,2008b),但還未見轉(zhuǎn)基因成功的報(bào)道,因此基因轉(zhuǎn)化的研究力度需要進(jìn)一步加大。(5)建立多基因轉(zhuǎn)化體系?？瓜x、抗病等性狀大多是由多基因控制的,單個(gè)基因的導(dǎo)入在抗蟲、抗病性狀改良中起的作用微小,且害蟲易對(duì)單個(gè)抗性基因產(chǎn)生耐受性。解決問題的有效途徑有2條。(1)將多個(gè)目標(biāo)基因直接融合或用調(diào)控元件隔開構(gòu)建在1個(gè)表達(dá)載體中。例如Chen等(2006a)利用gateway技術(shù)構(gòu)建了含有7個(gè)外源基因片段的多基因表達(dá)載體,并成功實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化,但在林業(yè)中還未見此類報(bào)道。(2)將多個(gè)單價(jià)基因分別構(gòu)建在多個(gè)表達(dá)載體上,利用基因槍等方法實(shí)現(xiàn)共同轉(zhuǎn)化。如王建革等(2006)將含有5個(gè)外源基因的4個(gè)表達(dá)載體成功導(dǎo)入庫安托楊(Populus×euramericana‘Guariento’),中試實(shí)驗(yàn)表明,多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株生長狀況良好。后一種共轉(zhuǎn)化途徑的共整合頻率和共表達(dá)頻率可能比前者要低。(6)完善核酶基因操作和基因轉(zhuǎn)化技術(shù)。核酶指具有催化功能的RNA分子,能夠完成自身的剪接反應(yīng)。據(jù)此可設(shè)計(jì)、合成特異性切割病毒RNA的核酶基因,導(dǎo)入植物中以驗(yàn)證抗病毒侵染的性能。該技術(shù)已在番茄(Solanumlycopersicum)和馬鈴薯(Solanumtuberosum)的抗病研究中得到應(yīng)用(朱秋菊,2005;張劍峰等,2008),但在林木研究中還未見相關(guān)報(bào)道。質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化在近年來應(yīng)用廣泛,成為新的研究熱點(diǎn)。葉綠體轉(zhuǎn)化體系利用葉綠體的同源片段將外源基因定點(diǎn)整合到植物的葉綠體基因組中,通過其高拷貝性實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá),在煙草、大豆(Glycinemax)、胡蘿卜(Daucuscarota)和棉花