飼料中微生物檢驗(yàn)

飼料中微生物檢查一、概述1.飼料微生物檢查的意義飼料微生物學(xué)檢查是飼料品質(zhì)控制的一種重要方面。正常條件下，飼料中微生物數(shù)量有限，但當(dāng)飼料因加工不當(dāng)、貯藏不善或因意外事故受到微生物污染時(shí)，微生物數(shù)量會(huì)有大幅度提高，并可有致病性微生物出現(xiàn)。微生物污染飼料后會(huì)帶來(lái)下列幾個(gè)方面的危害。(1)微生物繁殖過(guò)程中產(chǎn)生特殊的顏色和刺激性物質(zhì)，使飼料含有不良的外觀、滋味和氣味，影響飼料的適口性。(2)微生物繁殖過(guò)程中會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值減少。(3)微生物繁殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量有毒代謝產(chǎn)物，如細(xì)菌可產(chǎn)生內(nèi)毒素或外毒素，霉菌可產(chǎn)生霉菌毒素，因而造成動(dòng)物細(xì)菌毒素或霉菌毒素中毒，并可通過(guò)食物鏈影響人體健康。(4)造成動(dòng)物細(xì)菌性感染或霉菌性感染。(5)擾亂動(dòng)物消化道正常菌群，破壞動(dòng)物消化道微生態(tài)平衡，使動(dòng)物出現(xiàn)消化功效紊亂。因此，檢測(cè)飼料微生物指標(biāo)，控制飼料微生物數(shù)量，對(duì)確保飼料衛(wèi)生安全含有重要點(diǎn)義。2.飼料微生物的種類及形態(tài)飼料中常見(jiàn)的微生物重要涉及霉菌和細(xì)菌。霉菌(mold)并不是生物分類學(xué)名稱，而是指能在基質(zhì)上長(zhǎng)成絨毛狀、棉絮狀或蜘蛛網(wǎng)狀真菌的俗稱，是真菌的一部分。真菌是指有細(xì)胞壁、不含葉綠素、無(wú)根莖、葉，以寄生或腐生方式生存，僅少數(shù)類群為單細(xì)胞、其它都有分枝或不分枝的絲狀體，能進(jìn)行有性或無(wú)性繁殖的一類生物。真菌的形態(tài)有單細(xì)胞和多細(xì)胞兩種類型，霉菌為多細(xì)胞類型。在分類學(xué)上，霉菌分屬于真菌的藻狀菌綱(Phycomycets)、子囊菌綱(Ascomycets)和半知菌類(FungiImperfecti)。污染飼料的霉菌重要是曲霉菌屬、鐮刀菌屬和青霉菌屬的霉菌，可產(chǎn)生近200種霉菌毒素，其中比較重要的有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、雜色曲霉毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、二氫雪腐鐮刀菌烯酮、島青霉素、橘青霉京、黃綠青霉素等。值得注意的是，并非全部的霉菌都能產(chǎn)毒，或者說(shuō)能產(chǎn)毒的霉菌只是霉菌中的一少部分，同時(shí)還應(yīng)注意，即便是產(chǎn)毒霉菌，也是在其生長(zhǎng)到一定階段才會(huì)產(chǎn)毒，并不是在其整個(gè)生命期都能產(chǎn)毒。細(xì)菌(Bacterium)是一類含有細(xì)胞壁的單細(xì)胞微生物。它構(gòu)造簡(jiǎn)樸，無(wú)典型的細(xì)胞核，只有核質(zhì)，無(wú)核膜和核仁，不進(jìn)行有絲分裂，除核蛋白體外無(wú)其它細(xì)胞器，屬原核生物界。細(xì)菌的外形有球形、桿形、螺形，分別稱為球菌、桿菌、螺形菌(涉及弧菌與螺菌)。細(xì)菌個(gè)體很小，需用顯微鏡放大數(shù)百倍才干看見(jiàn)，普通以μm作為測(cè)量大小的單位。不同種類的細(xì)菌大小各異，同一種細(xì)菌的大小也可因菌齡和環(huán)境因素影響而有所差別。大多數(shù)球菌直徑約lμm，桿菌長(zhǎng)2～3μm，寬0.3～0.5μm。自然界細(xì)菌多個(gè)多樣，飼料中存在的細(xì)菌只是自然界細(xì)菌的一部分，其中涉及致病性、相對(duì)致病性和非致病性細(xì)菌。它們是評(píng)價(jià)飼料衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。3.飼料微生物檢查的普通辦法現(xiàn)在，飼料微生物學(xué)檢測(cè)重要涉及細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)、大腸桿菌群檢測(cè)、沙門(mén)氏菌檢測(cè)及霉菌總數(shù)檢測(cè)。飼料細(xì)菌總數(shù)是指1g(或mL)飼料中細(xì)菌的個(gè)數(shù)，但不考慮細(xì)菌的種類。細(xì)菌總數(shù)的高低反映了飼料的清潔程度及對(duì)動(dòng)物潛在的危險(xiǎn)性。細(xì)菌總數(shù)越高，表明飼料衛(wèi)生狀況越差，動(dòng)物受細(xì)菌危害的可能性越大。根據(jù)檢測(cè)計(jì)數(shù)辦法不同，飼料細(xì)菌數(shù)量有兩種表達(dá)辦法。一種是在嚴(yán)格規(guī)定的條件下，經(jīng)解決的樣品直接用平皿培養(yǎng)或經(jīng)微孔濾器過(guò)濾再行培養(yǎng)，使適應(yīng)培養(yǎng)條件下的活菌細(xì)胞必須并且只能生成一種肉眼可見(jiàn)的菌落，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算成果，稱為菌落總數(shù)；另一種辦法是將樣品適宜解決后，經(jīng)涂片染色或放入托馬氏細(xì)胞計(jì)數(shù)室，在顯微鏡下對(duì)菌體細(xì)胞直接計(jì)數(shù)，其中涉及活菌，也涉及尚未消亡的死菌，稱為細(xì)菌總數(shù)。我國(guó)采用前者，即采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)—一菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定。因此，我們所說(shuō)的飼料細(xì)菌總數(shù)實(shí)際為菌落總數(shù)，即飼料中的活菌數(shù)?？茖W(xué)研究證明，大腸菌群都是直接或間接來(lái)自于人和溫血?jiǎng)游锏募S便，因此，如在飼料中檢出大腸菌群，表明飼料曾受到過(guò)人或溫血?jiǎng)游锛S便的污染。由于大腸菌群與腸道致病菌來(lái)源相似，并且在普通條件下，大腸菌群對(duì)外界的抵抗力及在環(huán)境中的生存時(shí)間與重要腸道致病菌一致，因此，大腸菌群既可作為飼料與否受到人或溫血?jiǎng)游锛S便污染的標(biāo)志，也可作為飼料與否受到腸道致病菌污染的批示菌。大腸菌群在環(huán)境中廣泛存在，飼料中檢出大腸菌群，僅闡明飼料曾受到過(guò)人或溫血?jiǎng)游锛S便的污染，但并不表達(dá)一定有致病菌存在，這存在一種污染程度即菌量問(wèn)題。大腸菌群污染程度越高，致病菌存在的可能性就越大，因此，我國(guó)食品衛(wèi)生和飲水衛(wèi)生都對(duì)大腸菌群菌量作了嚴(yán)格限制?，F(xiàn)在，大腸菌群檢測(cè)多采用發(fā)酵法，即根據(jù)大腸菌群的培養(yǎng)特性，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)辦法推算出樣品中大腸菌群的最可能數(shù)(maximumprobablenumber，簡(jiǎn)寫(xiě)MPN)。沙門(mén)氏菌是重要的腸道致病菌，在飼料中不得檢出。飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)是根據(jù)其生化特性并結(jié)合血清學(xué)鑒定辦法進(jìn)行的。霉菌總數(shù)的檢測(cè)采用適合霉菌生長(zhǎng)而不適宜細(xì)菌生長(zhǎng)的高滲培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定，成果表達(dá)的是飼料中的活菌孢子數(shù)。霉菌毒素對(duì)動(dòng)物含有強(qiáng)烈的毒害作用，直接檢測(cè)飼料中的霉菌毒素含有重要意義，但由于霉菌毒素種類繁雜多樣，檢測(cè)過(guò)程比較麻煩，有些霉菌毒素還沒(méi)有抱負(fù)的檢測(cè)辦法，甚至在某些形變飼料中現(xiàn)在還根本不清晰都存在著哪些霉菌毒素，因此檢測(cè)飼料霉菌污染程度即霉菌總數(shù)就顯得非常必要。霉菌毒素是霉菌的有毒代謝產(chǎn)物，飼料霉菌總數(shù)越高，飼料受霉菌毒素污染的可能性就越大，同時(shí)，考慮到飼料霉變的其它危害，因此，在監(jiān)測(cè)飼料質(zhì)量及評(píng)價(jià)其飼用價(jià)值時(shí)，檢測(cè)飼料霉菌總數(shù)就含有十分重要的意義。飼料微生物檢測(cè)中，一種重要的原則是無(wú)菌觀念。從采樣、制樣到分離培養(yǎng)、生化鑒定等過(guò)程都必須堅(jiān)持無(wú)菌操作。二、飼料中細(xì)菌總數(shù)的檢查1.合用范疇本辦法合用于飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定。2.原理將試樣稀釋至適宜濃度，用特定的培養(yǎng)基，在（30±1）℃下培養(yǎng)（72±3）h，計(jì)數(shù)平板中長(zhǎng)出的菌落數(shù)，計(jì)算1g試樣中的細(xì)菌數(shù)量。3.儀器、設(shè)備(1)天平：感量為0.1g。(2)振蕩器：住復(fù)式。(3)干熱滅菌箱：[(50～200)±1]℃。(4)高壓滅菌鍋。(5)冰箱：普通冰箱。(6)恒溫箱：(30±1)℃。(7)電爐：可調(diào)式。(8)平皿：直徑為9cm。(9)吸管：容量為1，10mL。(10)三角燒瓶：容量為250，500mL。(11)玻璃珠。(12)試管：18mm×180mm。(13)水浴鍋：(46±1)℃。(14)酒精燈。(15)試管架。(16)橡皮乳頭。4.操作環(huán)節(jié)(1)采樣。采樣時(shí)必須特別注意樣品的代表性和避免采樣時(shí)的污染。首先準(zhǔn)備好滅菌容器和采樣工具，如滅菌牛皮紙袋或廣口瓶、金屬勺和刀，在衛(wèi)生學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，采用有代表性的樣品，樣品采集后應(yīng)盡快檢查，否則應(yīng)將樣品放在低溫干燥處。根據(jù)飼料倉(cāng)庫(kù)、飼料垛的大小和類型，分層定點(diǎn)采樣，普通可分三層五點(diǎn)或分層隨機(jī)采樣，不同點(diǎn)的樣品，充足混合后取500g左右送檢，小量存貯的飼料可使用金屬小勺采用上、中、下各部位的樣品混合。海運(yùn)進(jìn)口飼料采樣：每一船艙采用表層、上層、中層及下層4個(gè)樣品，每層從五點(diǎn)取樣混合，如船艙盛飼料超出10000t，則應(yīng)加采1個(gè)樣品。必要時(shí)采用有疑問(wèn)的樣品送檢。(2)試樣稀釋及培養(yǎng)。=1\*GB3①無(wú)菌稱取試樣10.0g，放入含有90mL稀釋液的滅菌三角燒瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)先加有適宜數(shù)量的玻璃珠)。經(jīng)充足振搖，制成1:10的均勻稀釋掖。最佳置振蕩器中以8000～l0000r/min的速度解決2～3min。=2\*GB3②用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，沿管壁慢慢注入含有9mL稀釋液的試管內(nèi)(注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液)，振搖試管，混合均勻，作成1:100的稀釋液。③另取一支1mL滅菌吸管，按上述操作次序，作10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即更換一支吸管。=4\*GB3④根據(jù)飼料衛(wèi)生原則規(guī)定或?qū)υ嚇游廴境潭鹊念A(yù)計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時(shí)，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。=5\*GB3⑤稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時(shí)將涼至(46±1)℃的平板計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基[可放置(46±1)℃水浴鍋內(nèi)保溫]注入平皿約15mL，小心轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使試樣與培養(yǎng)基充足混勻。從稀釋試樣到傾注培養(yǎng)基之間，時(shí)間不能超出15min。如預(yù)計(jì)到試樣中所含微生物可能在瓊脂平板表面生長(zhǎng)時(shí)，待瓊脂完全凝固后，可在培養(yǎng)基表面傾注涼至(46±1)℃的水瓊脂培養(yǎng)基4mL。=6\*GB3⑥待瓊脂凝固后，倒置平皿于(30±1)℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)(72±3)h取出，計(jì)數(shù)平板內(nèi)菌落數(shù)目，菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即得每克試樣所含細(xì)菌總數(shù)。(3)菌落計(jì)數(shù)辦法。作平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀察，必要時(shí)借助于放大鏡檢查，以防遺漏。在計(jì)數(shù)出各平板菌落數(shù)后，求出同一稀釋度兩個(gè)平板菌落的平均數(shù)。5.菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告(1)計(jì)數(shù)原則。選用菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落計(jì)數(shù)原則。每一稀釋度采用兩個(gè)平板菌落的平均數(shù)，如兩個(gè)平板其中一種有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不適宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，如片狀菌落不到平板的二分之一，而另二分之一菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2代表全平板菌落數(shù)。(2)稀釋度的選擇。①應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。②如有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30～300之間，視兩者之例如何來(lái)決定：如其比值不大于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；如不不大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字。=3\*GB3③如全部稀釋度的平均菌落數(shù)均不不大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)情之。④如全部稀釋度的平均菌落數(shù)均不大于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。=5\*GB3⑤如全部稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以不大于(＜)1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。=6\*GB3⑥如全部稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分不不大于300或不大于30時(shí)，則以最靠近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。(3)成果報(bào)告。菌落在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告；不不大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字背面的數(shù)值，以四舍五入辦法計(jì)算。為了縮短數(shù)字背面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來(lái)表達(dá)。附7.1稀釋液和培養(yǎng)基制備除特殊規(guī)定外，本原則所用化學(xué)試劑為分析純；生物制劑為細(xì)菌培養(yǎng)用；水為蒸餾水或無(wú)離子水。規(guī)定在實(shí)驗(yàn)條件下，所用試劑應(yīng)無(wú)克制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)存在。=1\*GB2⑴稀釋液=1\*GB3①成分氯化鈉(GBl266)8.5g；蛋白胨1.0g；蒸餾水1000mL。=2\*GB3②制法將上述成分加熱溶解，校正pH值使其在滅菌后保持7.0±2，按9mL/支分裝于試管，90mL/瓶分裝于三角燒瓶中，塞上棉塞包扎后(121±1)℃高壓滅菌20min。=2\*GB2⑵平板計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基=1\*GB3①成分蛋白胨5.0g；酵母浸膏2.5g；無(wú)水D-葡萄糖1.0g；瓊脂9~18g；蒸餾水l000mL。=2\*GB3②制法將上述成分加熱溶化，校正pH值使其在滅菌后保持7.0±2。過(guò)濾、分裝三角燒瓶中，包扎后(121±1)℃高壓滅菌20min。=3\*GB2⑶水瓊脂培養(yǎng)基=1\*GB3①成分瓊脂9～18g；蒸餾水1000mL。=2\*GB3②制法加熱使瓊脂溶化，校正pH值使其在滅菌后保持7.0±2。分裝三角燒瓶中，包扎后(121±1)℃高壓滅菌20min。上述稀釋液和培養(yǎng)基如不立刻使用，應(yīng)保存在0～5℃下，時(shí)間不超出1個(gè)月。三、飼料中霉菌的檢查1.合用范疇本辦法合用于飼料中霉菌的檢查。2.原理根據(jù)霉菌生理特性，選擇適宜于霉菌生長(zhǎng)而不適宜于細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，采用平皿計(jì)數(shù)辦法，測(cè)定霉菌數(shù)。3.設(shè)備及材料(1)天平：感量1g，最大秤量l000g。(2)顯微鏡：1500倍。(3)溫箱：[(25～28)±1]℃。(4)冰箱：普通冰箱。(5)高壓滅菌器：2.5kg。(6)干燥箱：[(50～250)±1]℃。(7)水浴鍋：[(45～77)±1]℃。(8)振蕩器：往復(fù)式。(9)微型混合器：2900r/min。(10)電爐。(11)酒精燈。(12)接種捧：鎳鉻絲。(13)溫度計(jì)：(100±1)℃。(14)載玻片。(15)蓋玻片。(16)乳缽。(17)試管架。(18)玻璃三角瓶：250，500mL。(19)試管：15mm×150mm。(20)平皿：直徑9cm。(21)吸管：1，10mL。(22)玻珠：直徑5mm。(23)廣口瓶：100，500mL。(24)金屬勺、刀等。(25)橡皮乳頭。4.培養(yǎng)基和稀釋液(1)高鹽察氏培養(yǎng)基，見(jiàn)附錄7.2。(2)稀釋液，見(jiàn)附錄7.2。(3)實(shí)驗(yàn)室慣用消毒藥品。5.操作環(huán)節(jié)(1)采樣。采樣時(shí)必須特別注意樣品的代表性和避免采樣時(shí)的污染。預(yù)先準(zhǔn)備好滅菌容器和采樣工具，如滅菌牛皮紙袋或廣口瓶、金屬勺和刀，在衛(wèi)生學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，采用有代表性的樣品，樣品采集后應(yīng)盡快檢查，否則應(yīng)將樣品放在低溫干燥處。根據(jù)飼料倉(cāng)庫(kù)、飼料垛的大小和類型，分層定點(diǎn)采樣，普通可分三層五點(diǎn)或分層隨機(jī)采樣，不同點(diǎn)的樣品，充足混合后，取500g左右送檢，小量存貯的飼料可使用金屬小勺采用上、中、下各部位的樣品的混合。海運(yùn)進(jìn)口飼料采樣：每一船艙采用表層、上層、中層及下層4個(gè)樣品，每層從五點(diǎn)取樣混合，如船艙盛飼料超出10000t，則應(yīng)加采同樣品。必要時(shí)采用有疑問(wèn)的樣品送檢。(2)以無(wú)菌操作稱取樣品25g(或25mL)放入含有225mL滅菌稀釋液的玻塞三角瓶中，置振蕩器上，振搖30min，即為1:10的稀釋液。(3)用滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入帶玻璃珠的試管中，置微型混合器上混合3min，或注入試管中，另用帶橡皮乳頭的1mL滅菌吸管重復(fù)吹吸50次，使霉菌孢子分散開(kāi)。(4)取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌稀釋液試管中，另?yè)Q一支吸管吹吸5次，此液為1:100稀釋液。(5)按上述操作次序作10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支lmL滅菌吸管，根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的預(yù)計(jì)，選擇3個(gè)適宜稀釋度，分別在作10倍稀釋的同時(shí)，吸取1mL稀釋液于滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿，然后將涼至45℃左右的高鹽察氏培養(yǎng)基注入平皿中，每皿15mL左右，充足混合，待瓊脂凝固后，倒置于[(25～28)±1]℃溫箱中，培養(yǎng)3d后開(kāi)始觀察，應(yīng)培養(yǎng)觀察1周。(6)汁算辦法。普通選擇菌落數(shù)在30～100個(gè)之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，同稀釋度的2個(gè)平皿的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克(或每毫升)檢樣中所含霉菌數(shù)。(7)成果報(bào)告。每克(或每毫升)飼料中含霉菌數(shù)以個(gè)/g（個(gè)/mL）表達(dá)。附7.2霉菌檢查用培養(yǎng)基和稀釋液制備除特殊規(guī)定外，所