基于1h-nmr和uplc技術(shù)的植物代謝組學(xué)分析

基于1h-nmr和uplc技術(shù)的植物代謝組學(xué)分析

遠(yuǎn)志是中醫(yī)學(xué)的一種常見植物，出現(xiàn)在漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》中。性溫,味辛、苦,歸心、腎、脾經(jīng),具安神益智、祛痰開竅、消散癰腫之功效。《雷公炮炙論》記載遠(yuǎn)志生品有“令人悶”的不良反應(yīng),并提出用甘草炮制,《得配本草》也指出遠(yuǎn)志“生用則刺激人咽喉”,因此遠(yuǎn)志臨床上多使用炮制品。經(jīng)考證,遠(yuǎn)志炮制方法可歸納為不加輔料的炒、焙、制炭等和加輔料的甘草制、蜜制、姜汁制、酒制和朱砂制等,根據(jù)應(yīng)用目的不同而采用具體的炮制方法。據(jù)考證,蜜制能增強(qiáng)遠(yuǎn)志化痰止咳作用,而甘草制則減緩其“戟人咽喉”的燥性,協(xié)同增加遠(yuǎn)志補(bǔ)脾益氣、安神益智之功效。臨床多使用蜜遠(yuǎn)志(honey-stir-bakedPolygalaeRadix,HSB-PR)和甘草制遠(yuǎn)志(liquorice-stir-boiledPolygalaeRadix,LSB-PR)。《中國藥典》2010年版一部收錄的遠(yuǎn)志炮制品為甘草制遠(yuǎn)志,說明蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志為應(yīng)用較廣的遠(yuǎn)志炮制品。生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志及甘草制遠(yuǎn)志化學(xué)成分的研究多集中在遠(yuǎn)志酸或遠(yuǎn)志皂苷元量的對比上,結(jié)果表明蜜制使遠(yuǎn)志皂苷元的量有所下降,甘草制則使其量上升。遠(yuǎn)志皂苷元是遠(yuǎn)志皂苷酸水解產(chǎn)物,《中國藥典》2005年版以遠(yuǎn)志皂苷元為遠(yuǎn)志皂苷的定量測定對照品,但由于遠(yuǎn)志皂苷結(jié)構(gòu)的特殊性,其酸水解產(chǎn)物不單一,因此以遠(yuǎn)志酸或遠(yuǎn)志皂苷元等酸水解產(chǎn)物為定量測定對照品不能準(zhǔn)確評價遠(yuǎn)志總皂苷的量。而遠(yuǎn)志皂苷堿水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單一,水解產(chǎn)物為細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷,《中國藥典》2010年版已將細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷作為遠(yuǎn)志總皂苷定量測定對照品,對于生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志及甘草制遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷量的對比研究則尚未見報道。遠(yuǎn)志化學(xué)成分較為復(fù)雜,以單一成分為指標(biāo)無法全面評價遠(yuǎn)志質(zhì)量,姜勇等基于HPLC指紋圖譜技術(shù)結(jié)合相似度評價軟件對遠(yuǎn)志不同部位及不同炮制品進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)蜜制品、甘草制品與生品的指紋圖譜未發(fā)生明顯改變,其認(rèn)為炮制并不會改變遠(yuǎn)志中所含化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。所采用的HPLC技術(shù)本身具有選擇性,整體性不強(qiáng),同時相似度評價軟件側(cè)重評價相似性,對于炮制引起的細(xì)小差異則無法看到,因此需要引入更加整體、更細(xì)微的評價方法評價遠(yuǎn)志生品及其炮制品的質(zhì)量。植物代謝組學(xué)技術(shù)是對植物提取物中代謝組進(jìn)行無差別代謝成分全分析的高通量分析技術(shù),從不同層面深入闡明初級及次生代謝產(chǎn)物,為中藥質(zhì)量控制打好基礎(chǔ)。核磁共振(nuclearmagneticresonance,NMR)技術(shù)由于其具有普適性,能夠檢測藥材中所有含氫代謝產(chǎn)物,但在靈敏度上有一定的局限性,對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的次級代謝產(chǎn)物分析能力較弱。而超高效液相色譜(ultraperformanceliquidchromatography,UPLC)技術(shù)具有較好的分離性能和較高的檢測靈敏度,且分析時間短,有機(jī)溶劑用量少,檢測成本低,方法靈敏、高效、準(zhǔn)確,決定其可以有效地對植物中次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地分離鑒定。因此,本實驗采用基于1H-NMR和UPLC的植物代謝組學(xué)技術(shù)從整體角度對生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志和甘草制遠(yuǎn)志代謝組進(jìn)行代謝組學(xué)研究,同時結(jié)合UPLC定量測定技術(shù)對其細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的量進(jìn)行考察,期望從新的角度為遠(yuǎn)志質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定和傳統(tǒng)炮制機(jī)制研究提供參考。1責(zé)任特性及樣品采集Bruker600MHzAvanceIIINMRSpectrometer(600.13MHz質(zhì)子頻率,德國布魯克公司600兆核磁儀),WatersAcquityUPLCH-Class(DAD檢測器,Waters公司)。重水(Norell,美國),氘代甲醇(99.8%,Merck,德國),氘代氫氧化鈉(Armar,瑞士),3-三甲基硅基[2,2,3,3-d4]氘代丙酸鈉(TSP,CambridgeIsotopeLaboratoriesInc.,MA),分析純甲醇(北京化工廠),色譜純乙腈、三氟乙酸、甲醇(Tedia,美國)。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷為實驗室自制,經(jīng)HPLC峰面積歸一化法測定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%。遠(yuǎn)志樣品于2010年10月采自山西新絳及絳縣遠(yuǎn)志種植基地,經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld.(二年生)的鮮品,陰干、抽心后得生遠(yuǎn)志。蜜遠(yuǎn)志及甘草制遠(yuǎn)志為實驗室自制,對新絳及絳縣生遠(yuǎn)志進(jìn)行蜜制和甘草制,得率分別為117%、100.7%。樣品在60℃下干燥5h,液氮研磨,過40目篩,保存?zhèn)溆谩＞唧w見表1。2方法2.11h-nmr代謝組學(xué)技術(shù)分析2.1.1超聲提取法精密稱取樣品1、3、5粉末各200mg置10mL玻璃離心管中,分別加3mL蒸餾水及3mL甲醇,加蓋漩渦混勻1min,超聲提取25min,以3500r/min室溫離心25min,移取上清液,減壓濃縮蒸干。殘渣用400μL氘代甲醇與400μL緩沖重氫水(緩沖重氫水:KH2PO4溶于D2O中,以1mol/L氘代氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0,含0.1%TSP)溶解,以13000r/min離心10min,移取600μL上清液于5mm核磁管中,備用。2.1.2傅里葉轉(zhuǎn)換線性程序tsp樣品在25℃下于600MHzNMR儀上測定(頻率600.13MHz),掃描次數(shù)為64,脈沖寬度為30℃,延遲時間為5.0s;傅里葉轉(zhuǎn)換線性窗函數(shù)為0.3Hz;相調(diào)節(jié)、基線調(diào)節(jié)及峰校正均為手動。所采用測定序列為noesyppr1d序列,抑制殘余水信號;內(nèi)標(biāo)為TSP;以氘代甲醇鎖場。2.2表1中splc代謝組的理論2.2.1柱溫2.2min色譜柱為AcquityUPLCBEHC18柱(55mm×2.1mm,1.7μm),以十八烷基鍵合硅膠為填充劑;乙腈-0.03%三氟乙酸水溶液為流動相梯度洗脫;運行時間為10min,洗脫梯度如下:0~1.3min(11∶89),1.3~2.3min(11∶89~19∶81),2.3~3.0min(19∶81~27∶73),3.0~4.0min(27∶73),4.0~5.0min(27∶73~34∶66),5.0~6.0min(34∶66~40∶60),6.0~6.5min(40∶60~42∶58),6.5~7.5min(42∶58),7.5~8.0min(42∶58~43∶57),8.0~9.0min(43∶57),9.0~10.0min(43∶57~11∶89);柱溫為40℃;體積流量為0.50mL/min;檢測波長為318nm;進(jìn)樣量為1μL。2.2.2超聲提取質(zhì)量取樣品1、3、5粉末各約1g,精密稱定,置具塞試管中,加50%甲醇10mL,稱定質(zhì)量,超聲提取40min,稱定質(zhì)量,用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,靜置,濾過。取續(xù)濾液用0.22μm微孔濾膜濾過,即得。2.2.3穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗取樣品1(生遠(yuǎn)志)的供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次,以考察該方法的精密度;另取該樣品供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件分別在0、3、6、9、12、24h進(jìn)樣,以考察其穩(wěn)定性;最后取該樣品5份,按“2.2.2”項下制備方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件檢測其重復(fù)性。上述結(jié)果通過數(shù)據(jù)處理軟件分析,結(jié)果表明各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致,各峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%,說明遠(yuǎn)志樣品制備方法的穩(wěn)定性、超高效液相色譜儀的精密度和檢測方法的重復(fù)性均良好。2.2.4uplc法的測量2.2.5峰面積歸一化處理對UPLC色譜圖中各色譜峰進(jìn)行手動積分,記錄各色譜峰的峰面積,對峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。歸一化后數(shù)據(jù)采用SIMCA-P11.0(Umetrics,瑞典)軟件進(jìn)行PCA分析,規(guī)格化方法為UV。根據(jù)PCA分析結(jié)果,結(jié)合t檢驗,尋找顯著性差異代謝產(chǎn)物。2.3測定了楚維諾細(xì)胞酸的測定2.3.1檢測條件和檢測波長色譜柱為AcquityUPLCBEHC18柱(55mm×2.1mm,1.7μm),以十八烷基鍵合硅膠為填充劑,甲醇-0.03%三氟乙酸水溶液(60∶40)為流動相等度洗脫,運行時間為6min,柱溫為40℃,體積流量為0.50mL/min,檢測波長為210nm,進(jìn)樣量為1μL。理論塔板數(shù)按細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷峰計算不低于3000。2.3.2對照品溶液的制備精密稱取細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷適量,加甲醇制成5.0mg/mL對照品溶液。分別精密吸取適量,加甲醇稀釋成0.60、1.50、2.40、3.00、3.60、4.50mg/mL的系列對照品溶液,備用。2.3.3樣品的提取和制備取各樣品粉末約0.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇10mL,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率400W,頻率40kHz)1h,放冷,再稱定質(zhì)量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液5mL,置圓底燒瓶中,蒸干,殘渣加10%氫氧化鈉溶液10mL,加熱回流2h,放冷,用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為4~5,用水飽和的正丁醇振搖提取3次,每次10mL,合并正丁醇液,回收溶劑至干,殘渣加甲醇適量使溶解,轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得。2.3.4標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣分析精密量取質(zhì)量濃度分別為0.60、1.50、2.40、3.00、3.60、4.50mg/mL的系列對照品溶液各1μL,按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析,測定峰面積。以峰面積的積分值(Y)對質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=1×106X+58206,r=0.9995,表明細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷在0.60~4.50mg/mL與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。2.3.5進(jìn)樣精密度試驗精密吸取5.0mg/mL的細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對照品溶液和樣品1(生遠(yuǎn)志)供試品溶液各1μL,注入UPLC色譜儀,按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次,考察其精密度,RSD為1.72%;取該樣品供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10、12、24h對其進(jìn)行分析,考察其穩(wěn)定性,測定并計算細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的量,RSD為2.7%,日內(nèi)穩(wěn)定性較好;取同一批生遠(yuǎn)志5份,按“2.3.3”項下制備方法制備供試品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件檢測其重復(fù)性,測定并計算細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷量的RSD為2.35%。2.3.6加樣回收率試驗取樣品1(生遠(yuǎn)志)9份,每份0.2g,精密稱定,均分為3組,每組分別精密加入一定量對照品溶液(含細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷分別為13.02、25.00、39.98mg),按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件測定并計算細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷的回收率,結(jié)果平均回收率分別為100.6%、99.2%、99.7%,RSD分別為1.7%、1.5%、1.2%。2.3.7樣品測定3結(jié)果3.1代謝認(rèn)3.1.1志1h-nmr圖譜中化合物的信號對生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志及甘草制遠(yuǎn)志的1H-NMR圖譜進(jìn)行直觀分析,發(fā)現(xiàn)其存在一定差異(圖1)。分析結(jié)果表明,與生遠(yuǎn)志相比,蜜遠(yuǎn)志1H-NMR圖譜多出的化合物信號主要集中在δ3.21~4.59,暗示蜜制所引入化合物主要為糖類化合物,其中δ4.6(d,J=7.9Hz)為β-葡萄糖;甘草制引入的化合物信號主要介于δ4.50~4.60和δ7.34~8.00內(nèi),同樣包含β-葡萄糖(δ4.6,J=7.9Hz);此外,δ7.34~8.00區(qū)為芳香區(qū),甘草制可能將其中的黃酮類成分引入遠(yuǎn)志炮制品中。3.2不同色譜圖分析對圖1、2進(jìn)行直觀分析,可看出生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志及甘草制遠(yuǎn)志的1H-NMR圖譜和UPLC色譜圖存在差異,特別是三者的UPLC色譜圖,保留時間3.33~5.50min(呫噸酮苷、蔗糖酯及寡糖酯混合區(qū))和6.67~8.00min(皂苷區(qū))存在明顯不同,因此對其進(jìn)行多元統(tǒng)計分析,能更加準(zhǔn)確、客觀地尋找差異性代謝產(chǎn)物。3.2.1差異代謝產(chǎn)物的統(tǒng)計分析(1)生、蜜遠(yuǎn)志1H-NMR代謝組差異分析由“3.2.1”項可知,生遠(yuǎn)志與蜜遠(yuǎn)志代謝產(chǎn)物組明顯不同,對兩者進(jìn)行進(jìn)一步PCA分析,數(shù)據(jù)矩陣為18×228。圖5為生遠(yuǎn)志與蜜遠(yuǎn)志1H-NMR圖譜PCA分析的散點圖和載荷圖。從圖5-A可看出,生遠(yuǎn)志與蜜遠(yuǎn)志沿PC1軸明顯分開,表明兩者代謝產(chǎn)物有明顯不同,化學(xué)成分差異較大。根據(jù)載荷圖(圖5-B)對差異性代謝成分進(jìn)行指認(rèn),得其差異性成分為纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酸、醋酸、琥珀酸、γ-氨基丁酸、酒石酸、馬來酸、芥子酸、富馬酸、膽堿、果糖、α-葡萄糖、蔗糖、腺嘌呤及3,6′-二芥子酰基糖酯。對其峰面積進(jìn)行t檢驗,找出具有顯著性差異的代謝產(chǎn)物,結(jié)果見表3。可以看出,與生遠(yuǎn)志相比,蜜遠(yuǎn)志中α-葡萄糖、甲酸的量明顯升高,蘇氨酸、丙氨酸、果糖和蔗糖的量明顯降低,都具有極顯著性差異(P<0.01)。(2)生、甘草制遠(yuǎn)志1H-NMR代謝組差異分析對生遠(yuǎn)志和甘草制遠(yuǎn)志的1H-NMR圖譜進(jìn)行PCA分析,數(shù)據(jù)矩陣為18×228。圖6為生遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志1H-NMR圖譜PCA分析的散點圖和載荷圖。圖6-A表明,PC1軸將生遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志明顯分開,說明兩者代謝產(chǎn)物存在差異。根據(jù)圖6-B對差異性代謝產(chǎn)物進(jìn)行指認(rèn),得其差異性成分為亮氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、谷氨酸、醋酸、琥珀酸、γ-氨基丁酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸、果糖、α-葡萄糖、蔗糖、腺嘌呤及3,6′-二芥子?；酋?。對其峰面積進(jìn)行t檢驗,顯著性差異代謝產(chǎn)物的量對比見表4?？梢钥闯?與生遠(yuǎn)志相比,甘草制遠(yuǎn)志中亮氨酸與酒石酸的量明顯升高,蘇氨酸、丙氨酸、琥珀酸、富馬酸和蔗糖的量明顯下降,且亮氨酸、丙氨酸、酒石酸和富馬酸具有顯著性差異(P<0.05),蘇氨酸、琥珀酸和蔗糖具有極顯著性差異(P<0.01)。(3)蜜制、甘草制遠(yuǎn)志1H-NMR代謝組差異分析從圖4得知,PCA分析可將兩種炮制品與生品明顯分開,但這兩種炮制品之間則沒有完全分開,因此對蜜遠(yuǎn)志和甘草制遠(yuǎn)志的1H-NMR圖譜進(jìn)行進(jìn)一步PLS-DA分析,數(shù)據(jù)矩陣為18×228。圖7為蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志1H-NMR圖譜PLS-DA分析的散點圖和載荷圖。從圖7-A可看出,蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志沿PC1軸完全分開,說明兩者的代謝組存在差異,化學(xué)成分有所不同。結(jié)合PLS-DA分析的載荷圖(7-B),找出如下差異性代謝產(chǎn)物:亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、醋酸、酒石酸、馬來酸、富馬酸、果糖、α-葡萄糖和蔗糖。對差異性成分峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗,結(jié)果見表5?？梢钥闯?與蜜遠(yuǎn)志相比,甘草制遠(yuǎn)志中甲酸和α-葡萄糖的量明顯降低,且具有極顯著性差異(P<0.01)。3.2.2兩種炮制品的差異根據(jù)“2.2.5”項下對遠(yuǎn)志生品、蜜制及甘草制品UPLC色譜圖處理,得34個變量,樣品為3組(每組樣品數(shù)n=6),得數(shù)據(jù)矩陣18×34,對其進(jìn)行PCA分析。圖8為生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志和甘草制遠(yuǎn)志UPLC色譜圖的PCA分析散點圖?？梢钥闯?生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志三者明顯分開,三者代謝組之間存在一定差異,說明生遠(yuǎn)志與炮制品之間化學(xué)組成存在一定差異,同時不同的炮制方法對生遠(yuǎn)志化學(xué)組成的改變不同。(1)生、蜜遠(yuǎn)志UPLC代謝組差異分析對生遠(yuǎn)志與蜜遠(yuǎn)志的UPLC色譜圖進(jìn)行PCA分析,數(shù)據(jù)矩陣為12×34。圖9為生遠(yuǎn)志與蜜遠(yuǎn)志UPLC色譜圖PCA分析的散點圖和載荷圖。圖9-A表明,生遠(yuǎn)志與蜜遠(yuǎn)志沿PC1軸明顯分開,二者代謝組明顯不同,化學(xué)成分差異較大。對圖9-B進(jìn)行分析,得生遠(yuǎn)志與蜜遠(yuǎn)志差異性代謝成分:3,6′-二芥子?；酋ァenuifolisideA、tenuifolioseI、tenuifolioseH、polygalaxanthoneIV、polagalasaponinXXXII、onjisaponinA和onjisaponinK。對其峰面積進(jìn)行t檢驗,找出顯著性差異代謝產(chǎn)物(表6)?？梢钥闯?與生遠(yuǎn)志相比,蜜遠(yuǎn)志中tenuifolioseI與onjisaponinA的量上升,3,6′-二芥子酰基糖酯、tenuifolisideA、polygalaxanthoneIV及tenuifolioseH的量下降。且tenuifolisideA具有顯著性差異(P<0.05),3,6′-二芥子?；酋ァolygalaxanthoneIV、tenuifolioseI、tenuifolioseH和onjisaponinA具有極顯著性差異(P<0.01)。(2)生、甘草制遠(yuǎn)志UPLC代謝組差異分析對生遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志UPLC色譜圖進(jìn)行PCA分析,數(shù)據(jù)矩陣為12×34。圖10為生遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志UPLC色譜圖PCA分析的散點圖和載荷圖。圖10-A顯示,生遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志沿PC1軸完全分開,兩者代謝產(chǎn)物存在差異,化學(xué)組成不同。結(jié)合圖10-B,可知其差異性代謝成分為polygalaxanthoneIV、3,6′-二芥子酰基糖酯、tenuifolisideA、polagalasaponinXXXII、tenuifolioseI、tenuifolioseH、onjisaponinA和onjisaponinK。對其峰面積進(jìn)行t檢驗,結(jié)果見表7。結(jié)果表明,與生遠(yuǎn)志相比,甘草制遠(yuǎn)志中tenuifolioseI、polagalasaponinXXXII和onjisaponinK的量上升,polygalaxanthoneIV、3,6′-二芥子酰基糖酯及tenuifolioseH的量則下降。且tenuifolioseI和onjisaponinK具有顯著性差異(P<0.05),3,6′-二芥子?；酋?、tenuifolioseH、polagalasaponinXXXII和polygalaxanthoneIV具有極顯著性差異(P<0.01)。(3)蜜制、甘草制遠(yuǎn)志UPLC代謝組差異分析從圖8可看出,PCA分析可使蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志完全分開,所以對蜜遠(yuǎn)志和甘草制遠(yuǎn)志UPLC圖譜進(jìn)行多元統(tǒng)計分析,尋找兩種炮制品間化學(xué)成分差異,數(shù)據(jù)矩陣為18×228。圖11為蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志UPLC圖譜PCA分析的散點圖和載荷圖。圖11-A顯示,蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志沿PC1軸明顯分開,說明兩者代謝組明顯不同,化學(xué)成分差異很大,根據(jù)圖11-B分析結(jié)果,得兩者差異性代謝產(chǎn)物有polygalaxanthoneIV、polagalasaponinXXXII、3,6′-二芥子?；酋ァenuifolisideA、tenuifolioseI、tenuifolioseH、onjisaponinA和onjisaponinK。對差異性代謝產(chǎn)物的色譜峰面積進(jìn)行t檢驗,結(jié)果見表8。結(jié)果表明,與蜜遠(yuǎn)志相比,甘草制遠(yuǎn)志中tenuifolioseI、3,6′-二芥子?；酋サ牧可?tenuifolioseH的量降低。3,6′-二芥子?；酋ベ|(zhì)量分?jǐn)?shù)具有顯著性差異(P<0.05),而tenuifolioseI和tenuifolioseH則具有極顯著性差異(P<0.001)。3.3不同指標(biāo)對遠(yuǎn)氧糖酯、甘草制總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響將遠(yuǎn)志生品、蜜制及甘草制品按“2.3.7”項下方法測定,UPLC色譜圖見圖12,并按回歸方程Y=1×106X+58206(r=0.9995)進(jìn)行計算,結(jié)果見表9。結(jié)果表明,與生遠(yuǎn)志相比,蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所變化,其中,蜜遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與生遠(yuǎn)志相比稍有下降,無顯著性差異;而甘草制遠(yuǎn)志中細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)則明顯上升,且具有極顯著性差異(P<0.01)。說明蜜制對遠(yuǎn)志總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響不大,而甘草制則使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升。綜上所述,與生遠(yuǎn)志相比,蜜遠(yuǎn)志總皂苷的量幾乎不變,氨基酸類物質(zhì)蘇氨酸和丙氨酸的量下降;有機(jī)酸類甲酸的量下降;糖類成分α-葡萄糖的量升高,果糖及蔗糖的量下降;糖酯類化合物3,6′-二芥子酰基糖酯、tenuifolioseA和tenuifolioseH的量下降,tenuifolioseI的量有所上升;呫噸酮類化合物polygalaxanthoneIV的量下降。甘草制遠(yuǎn)志中總皂苷的量明顯上升,氨基酸類物質(zhì)蘇氨酸和丙氨酸的量降低,亮氨酸的量有所升高;有機(jī)酸類酒石酸的量上升,琥珀酸與富馬酸的量下降;糖類蔗糖的量降低;糖酯類化合物3,6′-二芥子酰基糖酯和tenuifolioseH的量下降,tenuifolioseI的量上升;呫噸酮類化合物polygalaxanthoneIV的量有所上升。可看出遠(yuǎn)志生品與蜜制品、甘草制品代謝組存在一定差異,化學(xué)成分有很大不同,說明炮制會對藥材化學(xué)成分產(chǎn)生一定影響。另外,與蜜遠(yuǎn)志相比,甘草制遠(yuǎn)志中總皂苷類的量顯著性增高,3,6′-二芥子?；酋?、tenuifolioseI的量明顯升高,甲酸、α-葡萄糖、tenuifolioseH的量顯著降低。說明蜜遠(yuǎn)志與甘草制遠(yuǎn)志化學(xué)成分存在一定差異,提示不同炮制方法對生品代謝組的改變有所不同。4克氏原螯蝦對患者志組成的影響遠(yuǎn)志炮制方法歷代醫(yī)方本草均有記載,演變至今以密制、甘草制應(yīng)用較為廣泛。中醫(yī)炮制理論認(rèn)為蜜炙有增強(qiáng)遠(yuǎn)志化痰止咳活性功效,歷來就有“蜜炙甘緩而潤肺”之說,這可能是蜜遠(yuǎn)志的由來?！独坠谥苏摗分赋觥叭バ暮?熟甘草湯浸一宿”,為遠(yuǎn)志甘草炮制提供依據(jù)。同時,生遠(yuǎn)志亦從《本經(jīng)》時代沿用至今。說明遠(yuǎn)志生品、蜜制及甘草制品在臨床使用都具悠久歷史,本研究旨在為其臨床分開應(yīng)用提供化學(xué)支持。眾所周知,中藥中有效成分多為其次級代謝產(chǎn)物。遠(yuǎn)志中皂苷類成分為最主要的化學(xué)成分,在遠(yuǎn)志降血糖、鎮(zhèn)靜及祛痰等藥理活性中起到非常重要的作用,同時糖酯類代表性成分3,6′-二芥子酰基糖酯作為遠(yuǎn)志抗抑郁的主要活性成分,其量多寡極可能與遠(yuǎn)志的抗抑郁活性有密切關(guān)系,而呫噸酮類成分活性主要集中在抗菌、止痛等活性上,但有關(guān)polygalaxanthoneIV的活性研究較少。本研究表明蜜制對于遠(yuǎn)志中皂苷類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響不大,糖酯類3,6′-二芥子酰基糖酯和呫噸酮類polygalaxanthoneIV質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低;而甘草制則使遠(yuǎn)志總皂苷和呫噸酮類成分polygalaxanthoneIV質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高,糖酯類3,6′-二芥子?；酋ベ|(zhì)量分?jǐn)?shù)則有所下降。同時,植物中的初級代謝產(chǎn)物也具有一定的藥理活性,蘇氨酸和丙氨酸作為哺乳動物的必需氨基酸,有助于人體恢復(fù)疲勞、促進(jìn)生長發(fā)育、緩和低血糖及改善身體能量等,蔗糖是重要的能源物質(zhì)之一,能夠為人體提供能量并維持體溫,這三者對于人體來說都是非常重要的物質(zhì),其在生遠(yuǎn)志中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。另外,蜜遠(yuǎn)志中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的琥珀酸在人體有抑菌、抗?jié)兗疤岣呙庖吖δ艿茸饔谩８什葜七h(yuǎn)志中高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的富馬酸可以作為抗氧化劑進(jìn)行使用。而亮氨酸則能夠促進(jìn)生長激素分泌,并幫助燃燒節(jié)食和鍛煉極難產(chǎn)生效果的內(nèi)臟脂肪,其在蜜制及甘草制品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)都較高。綜上所述,生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志及甘草制遠(yuǎn)志化學(xué)成分各不相同,導(dǎo)致其藥理活性可能也不盡相同。其中,生遠(yuǎn)志中3,6′-二芥子?；酋ベ|(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,制遠(yuǎn)志總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,這可能導(dǎo)致兩者具有不同的藥理活性;同時蜜遠(yuǎn)志中總皂苷和3,6′-二芥子酰基糖酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)與生遠(yuǎn)志相比,都有所下降,其可能更有利于止咳方面的治療,因此三者在應(yīng)用時可根據(jù)用途不同而適當(dāng)選取,即所謂的對癥下藥。實驗結(jié)果表明,中藥成分復(fù)雜多變,不同成分的改變可能對應(yīng)不同的藥理活性,同時從化學(xué)角度證明炮制可整體改變藥性及藥效。本研究從新的角度對遠(yuǎn)志生品及制品進(jìn)行評價,為傳統(tǒng)藥物研究提供了新的思路。2.1.3分析主觀變化核磁圖譜采用MestReNova(version6.2.4,MestrelabResearch,SantiagodeCompostella,西班牙)進(jìn)行處理。以δ0.04積分段對化學(xué)位移區(qū)間δ0.48~10.0進(jìn)行分段積分,其中δ4.70~5.02(殘余水峰)和δ3.30~3.38(殘余甲醇峰)不進(jìn)行積分。積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后,采用SIMCA-P11.0(Umetrics,瑞典)軟件進(jìn)行主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)和偏最小二乘法判別分析(partialleassquaresdiscriminantanalysis,PLS-DA),規(guī)格化方法為UV。根據(jù)分析結(jié)果,找出差異性代謝產(chǎn)物