端粒酶中RNA突變

端粒酶中RNA的突變

主要內(nèi)容1端粒及端粒酶2端粒酶中RNA突變及其后果3影響端粒酶長度和活性的其他因素4小結(jié)1端粒及端粒酶

三位美國科學(xué)家(ElizabethH.Blackburn,CarolW.Greider和JackW.Szostak)因發(fā)現(xiàn)“端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體的”獲得了2009年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

真核染色體的末端結(jié)構(gòu)，為一特定的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)。其DNA序列由對生物特異的簡單的串聯(lián)重復(fù)單位組成，能抵消每一輪DNA復(fù)制中因染色體降解而造成的關(guān)鍵功能碼序列的丟失，使正常染色體端部間不發(fā)生融合，保證每條染色體的完整性。1.1端粒1.2端粒酶端粒酶通過引物特異識別位點，以自身RNA為模板，在染色體末端合成端粒DNA，使端粒得以延長，為后續(xù)DNA聚合酶合成完整的染色體提供了平臺。人類端粒酶主要由RNA成分(hTER或hTR)、端粒酶相關(guān)蛋白1(hTEP1)和催化亞單位(hTERT)三部分組成。hTR長約451nt，其中有11個堿基(5’

-CUAACCCUAA-3’)與人類端粒序列5’

-TTAGGG-3’互補(bǔ)，與此區(qū)互補(bǔ)的反義寡核苷酸能抑制端粒酶活性，而這段RNA的突變會導(dǎo)致端粒酶活性的改變。hTEP1的mRNA表達(dá)并不限于有端粒酶活性的組織和細(xì)胞系，各組織的水平差異與端粒酶的活性無關(guān)，因此，端粒酶活性表達(dá)并不是由TEP1決定的，但hTERT則是端粒酶活性所必需的。作為RNA依賴的DNA聚合酶，區(qū)別于一般的蛋白逆轉(zhuǎn)錄DNA聚合酶，hTERT可識別單鏈富含G的寡核苷酸引物，以其RNA組分的堿基為模板與端粒重復(fù)序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，在合成、延伸堿基序列中起催化作用。2端粒酶中RNA突變及其后果當(dāng)插入一個小遺傳突變到癌細(xì)胞端粒酶RNA中，它們的生長減慢到細(xì)胞“自殺”的水平。ElizabethBlackburn說：“這就象毒針一樣，你只需要加一點點就可以得到顯著的效果?！边@種突變的目標(biāo)是一個在癌細(xì)胞中高度活躍的端粒酶，在該酶中的遺傳密碼中插入了一個由RNA構(gòu)成的小突變。突變的RNA阻斷了端粒酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，該突變使用端粒酶來破壞迅速擴(kuò)增的癌細(xì)胞。2.1突變類型MT-hTers在四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)(AU5和U11)或四環(huán)素抑制系統(tǒng)(49A)控制下表達(dá)。AU5和U11轉(zhuǎn)染到LNCaP（前列腺癌細(xì)胞系），49A轉(zhuǎn)染到MCF-7（乳腺癌細(xì)胞系）。WT-hTER也轉(zhuǎn)染到以上兩種細(xì)胞類型中做對比。Fig.4A.Expressionofmutant-templatetelomeraseRNA.ThetemplatesequencesofWT,AU5,U11,and49AtelomeraseRNAsareindicatedbelow.2.2表達(dá)WT和MT的分析

Northernblotting來分析所有的hTER轉(zhuǎn)錄的分子形態(tài)的水平。由于啟動子的轉(zhuǎn)錄起始位點不同，引進(jìn)的基因結(jié)構(gòu)（箭頭）應(yīng)該比內(nèi)生型的hTER（條）長80個堿基。突變型的基因表達(dá)水平明顯比野生型的低，野生型的基因在不同的細(xì)胞體系中的表達(dá)水平差不多。Fig.4B.NorthernblottinganalysisofvariousWT-hTER-andMT-hTer-expressingclonallines.2.2表達(dá)WT和MT的分析1kb的片段經(jīng)研究表明是具有多聚腺苷酸的片段，300bp的降解產(chǎn)物是多聚腺苷酸。盡管它們在一些細(xì)胞系中積累的水平很高，但是不影響細(xì)胞的增殖。只有成熟的加工過的端粒酶RNA與端粒酶的活性有關(guān)。Fig4(A).Expressionofmutant-templatetelomeraseRNA.(B).NorthernblottinganalysisofvariousWT-hTER-andMT-hTer-expressingclonallines.2.3細(xì)胞培養(yǎng)分析3H標(biāo)記的T的結(jié)合速率用來定量細(xì)胞的增殖。細(xì)胞系接種到含有3H標(biāo)記的T不同的細(xì)胞濃度中對其進(jìn)行18h的培養(yǎng)，野生型與AU5、49A相比結(jié)合的3H標(biāo)記的T分別高3倍和8倍，雖然U11和WT的統(tǒng)計數(shù)據(jù)差異不大，但是它降低了長期的細(xì)胞增殖率，增加了細(xì)胞凋亡。從長期的培養(yǎng)來看，野生型的無性繁殖系維持快速地細(xì)胞增殖，而突變型的基因引起了增殖缺陷。Fig5.MT-hTerexpressiondecreasescellproliferationandviability.(3H-thymidineincorporation)2.4菌落平板分析

菌落平板分析表明WT平均的菌落形成效率比AU5、49A的分別高30倍和12倍，但是U11與WT之間的差別不是太顯著。這也證實了細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)論。Fig5.M