第1講 基因工程導(dǎo)論 應(yīng)用和安全性管理 2012

基因工程

geneticengineering生物工程微生物工程基因工程細胞工程酶工程緒論學(xué)科誕生的理論和技術(shù)基礎(chǔ)基因工程的概念和研究內(nèi)容基因工程的應(yīng)用和發(fā)展基因工程的研究動態(tài)基因工程技術(shù)誕生的3大理論基礎(chǔ)▼

20世紀40年代，O.T.Avery發(fā)現(xiàn)生物遺傳信息的化學(xué)本質(zhì)是DNA而非protein(肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗)

▼20世紀50年代，Watson-Crick提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型；半保留復(fù)制機理；解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題

▼20世紀60年代，相繼提出“中心法則”和操縱子學(xué)說,成功破譯遺傳密碼43，闡明遺傳信息的流向和表達問題20世紀40-60年代的3大理論發(fā)現(xiàn)，從理論上確立了基因工程的可能性，但在進行基因工程技術(shù)操作時，

科學(xué)家仍面臨3個基本技術(shù)問題：①如何從生物體龐大的雙鏈DNA分子中將所需要的基因片段切割下來；②如何將所切割下來的DNA片段進行繁殖擴增；③如何將所獲得的基因片段重新進行連接。

▼“基因剪刀”－限制性內(nèi)切酶

1970年H.O.Smith和K.W.Khorana在流感嗜血桿菌(Haemophilusinffuenzae)中分離純化了第1個核酸限制性內(nèi)切酶HindⅡ1972年H.W.Boyer實驗室首先發(fā)現(xiàn)EcoRI核酸內(nèi)切酶

基因工程技術(shù)誕生的5大技術(shù)基礎(chǔ)

1970年Baltimove和Temin等同時各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，完善了遺傳學(xué)中心法則，使真核基因的制備成為可能▼逆轉(zhuǎn)錄酶1、真核基因組龐大而復(fù)雜，基因圖譜不易制得，2、基因多有內(nèi)含子，不能在原核表達系統(tǒng)剪接出成熟的mRNA，難以獲得相應(yīng)的產(chǎn)物，逆轉(zhuǎn)錄酶的用途：mRNA→cDNA(complementoryDNA）→構(gòu)建文庫、分離目的基因▼連接酶

1967年世界上5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)DNA連接酶：該酶參與DNA單鏈裂口(gap)或缺口(nick)的修復(fù)，連接DNA分子的自由末端

1970年Wisconsin大學(xué)H.G.Khorana實驗室發(fā)現(xiàn)T4DNA連接酶活性更高，能催化完全分離的兩段DNA分子進行平末端的連接▼載體

早期載體工作的研究對象：噬菌體；側(cè)重于研究病毒和寄主細菌間的關(guān)系1946年L.Berg研究細菌性因子(F因子),50-60年代相繼發(fā)現(xiàn)抗藥性R因子：分子量小，具有抗藥性選擇標記和易于操作等優(yōu)點1973年S.Cohen將質(zhì)粒作為基因工程載體使用20世紀40年代Avery發(fā)現(xiàn)外源DNA分子導(dǎo)入細菌細胞的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(肺炎鏈球菌實驗，發(fā)現(xiàn)DNA是遺傳信息的攜帶者而非蛋白質(zhì))▼受體1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細胞經(jīng)過氯化鈣的適當(dāng)處理后，便能夠吸收λ噬菌體的DNA1972年以后，大腸桿菌成為分子克隆的良好受體20世紀70年代的上述發(fā)現(xiàn)，從技術(shù)層面上解決了用基因工程改良生物的實際問題，最終促成了基因工程學(xué)科的誕生

第一個重組體的構(gòu)建

1972年，美國斯坦福大學(xué)P.Berg等在PNAS上發(fā)表了題為∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，標志著基因工程技術(shù)的誕生2個重大歷史事件1972年，美國斯坦福大學(xué)

P.Berg博士等用E.coRⅠ酶切猿猴病毒SV40DNA和λphageDNA后，用T4DNA連接酶將兩種消化片段連接成重組體分子

意義：世界上第一次成功的DNA體外重組實驗

P.Berg的貢獻：

第一個有功能的重組體的構(gòu)建◆雖然Berg的工作具有劃時代的意義，但是他們并沒有證明體外重組的DNA分子具有生物學(xué)功能◆1973年，S.N.Cohen等在PNAS上發(fā)表文章“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）宣布體外構(gòu)建的細菌質(zhì)粒能夠在細胞中進行表達，完善了Berg開創(chuàng)的基因重組技術(shù)Cohen的貢獻：

1973年,斯坦福大學(xué)

S.N.Cohen等將E.coli的R6-5質(zhì)粒DNA：編碼卡那霉素（kanamycin）抗性基因pSC101質(zhì)粒：編碼四環(huán)素（tetracycline）抗性基因

體外切割并連接成重組體分子，轉(zhuǎn)化E.coli，篩選出了具雙抗抗性的菌落,實現(xiàn)了細菌遺傳性狀的轉(zhuǎn)移中國的胰島素生產(chǎn)之路：1998年，中國成功研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因重組人胰島素。世界上三個能生產(chǎn)基因重組人胰島素的國家：美國、丹麥和中國1982年，第一個基因工程藥物在美國批準上市：基因重組人胰島素

（通化東寶-甘舒霖：95年開始研發(fā)，98年成功，2008年規(guī)模生產(chǎn)，亞洲最大）徐州萬邦？BoyerandCohen

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研究策略基因和基因工程的概念

基因（gene）是遺傳學(xué)家約翰（W.Johannsen）在1909年提出來的，他用基因這一名詞來表示遺傳的獨立單位，相當(dāng)于孟德爾在