佛手益氣活血湯對(duì)血栓閉塞性脈管炎模型大鼠血漿xb2、6-酮-前列腺素f

佛手益氣活血湯對(duì)血栓閉塞性脈管炎模型大鼠血漿xb2、6-酮-前列腺素f

血栓形成性靜脈炎（tao）是一種慢性靜脈炎、節(jié)段性和復(fù)發(fā)性疾病，也被稱為buere病。這是由男性年輕人引起的。主要影響四肢的中、小動(dòng)脈，尤其是下肢。通常導(dǎo)致遠(yuǎn)端缺血性病變。在嚴(yán)重的情況下，下肢潰瘍和壞死會(huì)導(dǎo)致較高的致殘率和治療。本研究擬通過(guò)觀察佛手益氣活血湯對(duì)血栓閉塞性脈管炎模型大鼠血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響,探討佛手益氣活血湯對(duì)大鼠血栓閉塞性脈管炎的治療作用及其機(jī)制。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1.2免疫組化染色試驗(yàn)劑盒血栓素B2放射免疫分析試劑盒、6-酮-前列腺素F1α放射免疫分析試劑盒均由北京北方生物技術(shù)研究所提供,批號(hào):130120;SABC免疫組化染色試劑盒(兔IgG)由上海研吉生物科技有限公司提供;月桂酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司,批號(hào):20111011);水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,批號(hào):20111105);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司生產(chǎn),批號(hào):Y1206217);佛手益氣活血湯由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房提供(經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院楊喜倉(cāng)主任中藥師鑒定)。1.3酶控制系統(tǒng)H.H.S21-4電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械五廠);800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械十廠);101電熱恒溫干燥箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠);KDC-2044低速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司),GC-911r放射免疫計(jì)數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);AO-82轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(美國(guó)),AO-940自動(dòng)磨刀機(jī)(美國(guó));成都泰盟BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(免疫組化分析軟件;成都泰盟科技有限公司);山東易創(chuàng)MiE圖像處理系統(tǒng)(山東易創(chuàng)電子有限公司);CX21型生物光學(xué)顯微鏡(Olympus,日本)。1.4方法1.4.1中劑量高劑量制備組佛手益氣活血湯高、中、低劑量30.0、15.0、7.5g生藥/kg,取藥材105g,加水適量浸泡30分鐘,文火煎煮45分鐘,濾出;藥渣加水適量,文火煎煮30分鐘,濾出,合并2次濾液,減壓低溫濃縮至35mL,制備成高劑量藥液。取高劑量藥液10mL,加水10mL,混勻,制備成中劑量藥液;取中劑量藥液10mL,加水10mL,混勻,制備成低劑量藥液。1.4.2各組大鼠的皮膚長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)將大鼠60只隨機(jī)分為5組,每組12只,分別為:假手術(shù)組,模型對(duì)照組,佛手益氣活血湯高、中、低劑量組。參照文獻(xiàn)方法稍加改進(jìn)制作大鼠血管閉塞性脈管炎(TAO)模型:大鼠用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉,仰位固定后,左下肢股內(nèi)側(cè)剪毛。2%碘伏局部皮膚消毒,取腹股溝中點(diǎn)至膝內(nèi)側(cè)縱行切口,長(zhǎng)約1.5~2.0cm,分離皮下組織,游離股動(dòng)脈,股動(dòng)脈近端用動(dòng)脈夾阻斷血流,假手術(shù)組于動(dòng)脈夾下方遠(yuǎn)心端注入0.2mL生理鹽水,其余大鼠于動(dòng)脈夾下方向遠(yuǎn)心端注入l0mg/mL的月桂酸鈉溶液0.2mL,直至血管明顯充盈,略顯白色而無(wú)明顯腫脹時(shí),輕柔取針。各組均于注射后15分鐘松開(kāi)動(dòng)脈夾,查無(wú)活動(dòng)性出血,縫合皮膚。術(shù)后給予青霉素20萬(wàn)U/只腹腔注射,預(yù)防感染。佛手益氣活血湯高、中、低劑量組大鼠分別灌胃佛手益氣活血湯30.0、15.0、7.5g生藥/kg(相當(dāng)于臨床成人日用量的20、10、5倍);假手術(shù)組及模型對(duì)照組大鼠分別灌胃10mL/kg生理鹽水。各組均于手術(shù)前l(fā)小時(shí)灌胃給藥,以后每天灌胃給藥1次,連續(xù)14天。1.4.3血清分離血組末次給藥4小時(shí)后從切開(kāi)的大鼠股靜脈收集靜脈血約2mL,室溫靜置4小時(shí),3000轉(zhuǎn)離心10分鐘,分離血清,另取靜脈血約2mL,加入抗凝管,3500轉(zhuǎn)離心15分鐘,分離血漿,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。處死?dòng)物,切開(kāi)大鼠造模側(cè)后肢內(nèi)收肌,切取肌肉,生理鹽水快速?zèng)_洗后,置4%中性多聚甲醛液中固定,保存?zhèn)溆谩?.4.4酶表1水平應(yīng)用放射免疫法對(duì)大鼠血漿TXB2、6-Keto-PGF1α水平進(jìn)行檢測(cè);應(yīng)用免疫組化法對(duì)大鼠血管VEGF的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.5組間多重比較方法數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以(ue0af±s)表示,采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。2結(jié)果2.1影響模型中txb2水平的影響佛手益氣活血湯高、中、低劑量對(duì)血栓素B2表達(dá)有降低作用,與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。2.2keto-pgf1表達(dá)佛手益氣活血湯高、中、低劑量對(duì)6-Keto-PGF1α表達(dá)有升高作用,與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。2.3光密度對(duì)對(duì)照組的作用佛手益氣活血湯高、中劑量對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子平均光密度有降低作用,與模型對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。3治療大鼠血栓閉塞性脈管炎的臨床常用治療方現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)血栓閉塞性脈管炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,一般認(rèn)為其發(fā)病是多種因素綜合作用的結(jié)果,可能與吸煙、寒冷、免疫反應(yīng)、遺傳因素、性激素、感染等因素有關(guān),特別與吸煙關(guān)系密切。目前臨床上缺乏可靠理想的治療手段,最有效的治療仍是外科治療,其目的是恢復(fù)或改善患肢血液供應(yīng),重建缺血肢體血供,保留患肢部分功能,避免截肢,但手術(shù)治療并不能改變血管病變的病程,術(shù)后有再狹窄、再閉塞甚至有再截肢的可能。祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)血栓閉塞性脈管炎的辨證論治積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),本病屬中醫(yī)學(xué)“脫疽”范疇,又稱之為“脫癰”“十指冷落”。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就指出了本病后期的典型癥狀、預(yù)后及手術(shù)治療原則,如《靈樞·癰疽》篇曰:“發(fā)于足趾,名脫癰,其狀赤黑,死之治治;不赤黑,不死。治之不衰,急斬之,不則死矣?！逼洳∫蚨酁榍橹?、飲食、起居等因素導(dǎo)致臟腑功能失調(diào),寒邪客于經(jīng)絡(luò),營(yíng)血凝滯,血脈瘀阻,壅遏不通,肢體失于濡養(yǎng),遂成本病。如《諸病源候論》所載:“疽者,五臟不調(diào)所生也,若喜怒不測(cè),飲食不節(jié),陰陽(yáng)不和,則五臟不調(diào),營(yíng)衛(wèi)虛寒,腠理則開(kāi),寒客經(jīng)絡(luò)之間,經(jīng)絡(luò)為寒所折,則營(yíng)衛(wèi)稽留于脈……營(yíng)血得寒則澀而不行,衛(wèi)氣從之與寒相搏,亦壅遏不通……故積聚成疽……發(fā)于足趾,名曰脫疽。”其病程遷延,日久化熱,敗血腐肉,病至后期,肢節(jié)壞死,創(chuàng)面不愈,膿血不斷,氣血大傷,變證叢生。治療多采用培補(bǔ)氣血,溫經(jīng)散寒,活血通絡(luò),清熱解毒等方法。佛手益氣活血湯是在古方“佛手散”的基礎(chǔ)上加減并重用岷當(dāng)歸而成,具有補(bǔ)氣活血,疏通脈絡(luò)的作用。相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn)研究表明當(dāng)歸、川芎及其配伍能夠改善血液流變性與微循環(huán),保證腦血流量,對(duì)機(jī)體免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)功能。本研究發(fā)現(xiàn)佛手益氣活血湯對(duì)大鼠血栓閉塞性脈管病變程度炎具有一定的改善作用,對(duì)模型大鼠血漿6-Keto-PGF1α水平具有升高作用,對(duì)TXB2及肌肉VEGF表達(dá)具有降低作用。前列環(huán)素(PGI2)是血管內(nèi)皮細(xì)胞及其他一些細(xì)胞花生四烯酸代謝的一種生物活性物質(zhì),具有強(qiáng)烈的抑制血小板聚集和舒張血管的作用。由于前列環(huán)素生物半衰期約3分鐘,一般通過(guò)測(cè)定其穩(wěn)定的衍生物6-酮-前列腺素F1α來(lái)了解PGI2的生成。而血栓素A2(TXA2)也是花生四烯酸代謝的一種生物活性物質(zhì),具有強(qiáng)烈的促血小板聚集和血管收縮作用。由于TXA2不穩(wěn)定,故通常測(cè)定其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物TXB2來(lái)了解TXA2的生成。正常生理狀況下,血液中TXA2和PGI2含量保持相對(duì)平衡狀態(tài),從而保持血管的通暢、調(diào)節(jié)體內(nèi)血流的正常流動(dòng),以共同維持血液運(yùn)行的正常狀態(tài);當(dāng)血管損傷時(shí)TXA2分泌增多,PGI2減少,則會(huì)導(dǎo)致血小板聚集、血栓形成加速。而佛手益氣活血湯可使大鼠血栓閉塞性脈管炎模型血漿TXB2降低、血漿6-K-PGF1α升高,說(shuō)明其能夠用于大鼠血栓閉塞性脈管炎模型血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)前列腺素合成酶活性增加,催進(jìn)血小板生成PGI2,減少TXA2的生成,從而抑制血小板聚集和血管收縮,減少血栓的形成,改善血液流變性,減輕大鼠血栓閉塞性脈管炎模型的病變程度。血管表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是目前公認(rèn)的最具特異性且作用最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生長(zhǎng)因子,缺氧調(diào)節(jié)的特性使它成為重要的促新生血管生成因子,參與缺氧誘導(dǎo)的新生血管形成。VEGF在正常成人和動(dòng)物組織中表達(dá)水平較低,在病理?xiàng)l件下,VEGF無(wú)論是在mRNA水平還是在蛋白水平均有過(guò)量表達(dá),而缺血缺氧是VEGF及其受體(VEGFR)表達(dá)上調(diào)的強(qiáng)效誘發(fā)因素,可促使VEGFmRNA和蛋白表達(dá)、生物活性均有所增加。佛手益氣活血湯降低大鼠血栓閉塞性脈管炎模型VEGF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),說(shuō)明其能改善大鼠TAO模型患肢缺血、缺氧的病理狀態(tài)。本研究顯示佛手益