柴胡皂苷a對難治性癲癇大鼠多藥耐藥蛋白p-糖蛋白表達(dá)的影響

柴胡皂苷a對難治性癲癇大鼠多藥耐藥蛋白p-糖蛋白表達(dá)的影響

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)中常見的疾病。中國有600.700萬患者，其中30%的患者出現(xiàn)癲癇發(fā)作，由于抗癲癇藥物的抗癲癇藥物或其他原因，通道轉(zhuǎn)換變得困難。由于難治性癲癇發(fā)作頻繁,嚴(yán)重影響患者的學(xué)習(xí)、工作和生活,甚至嚴(yán)重致殘,因此研究難治性癲癇發(fā)病機(jī)制及尋找有效的治療方法十分必要。柴胡為臨床常用中藥之一,具有鎮(zhèn)靜、止痛、降溫、鎮(zhèn)咳、抗炎抗菌、保肝利膽、降血壓、抗病毒、抗腫瘤等作用,柴胡皂苷a(saikosaponina,SSa)為柴胡主要藥理成分柴胡皂苷的一種單體成分,研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷a具有抑制戊四氮致癇大鼠癇性發(fā)作的作用。此實(shí)驗(yàn)建立了氯化鋰-匹魯卡品難治性癲癇模型,以進(jìn)一步探討SSa的抗癲癇作用機(jī)制。1材料表面1.1動(dòng)物雄性SPF級(jí)SD大鼠,體重180~220g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(粵)2006-0015。1.2托品注射液、丙戊酸鈉合成制劑氯化鋰(美國,Sigma公司,批號(hào)115K1308),鹽酸匹魯卡品(美國,Sigma公司,批號(hào)066k1730),硫酸阿托品注射液(鄭州羚銳制藥有限公司,批號(hào)0905052),丙戊酸鈉片劑(VPA,杭州賽諾菲圣德拉保民生制藥有限公司,批號(hào)0402049)。SSa(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院),小鼠抗大鼠P-糖蛋白單克隆抗體(C219,Abcam公司,貨號(hào)ab3364),羊抗小鼠IgG-HRP(武漢博士德生物工程有限公司)?？逻_(dá)2000MM全光譜多功能活體成像系統(tǒng)(美國,Kodak公司)。2方法2.1癲癇持續(xù)時(shí)間用藥實(shí)驗(yàn)大鼠癲癇性發(fā)作行為參照TurskiWA和王本國等人的方法,小劑量反復(fù)ip匹魯卡品制備難治性癲癇大鼠模型。SD大鼠首先ip氯化鋰(127mg·kg-1),18~24h后ip阿托品1mg·kg-1,30min后ip匹魯卡品(10mg·kg-1)。如未出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus,SE),則每隔30min繼續(xù)ip匹魯卡品(10mg·kg-1),直至大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后停止注射,空白對照組(A)大鼠ip等體積的生理鹽水。大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作持續(xù)>60min時(shí),以10%的水合氯醛(300mg·kg-1)ip終止發(fā)作。癇性發(fā)作行為觀察,參照Racine標(biāo)準(zhǔn),0級(jí):無發(fā)作反應(yīng);Ⅰ級(jí):節(jié)律性口角、耳或面部肌肉抽動(dòng)陣攣;Ⅱ級(jí):點(diǎn)頭并伴隨更嚴(yán)重的面部肌肉抽動(dòng)陣攣;Ⅲ級(jí):出現(xiàn)前肢陣攣但不伴隨直立;Ⅳ級(jí):前肢陣攣伴隨直立;Ⅴ級(jí):全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作而跌倒。Ⅳ級(jí)以上發(fā)作為成功的癲癇持續(xù)狀態(tài)模型,未達(dá)到Ⅳ~Ⅴ級(jí)發(fā)作的棄用。2.2癲癇發(fā)作監(jiān)測癲癇狀態(tài)后的大鼠經(jīng)過急性期24h后,進(jìn)入10~15d左右的潛伏期,腹腔注射5%糖鹽水5mL,2次/d。15d后進(jìn)入4周慢性期,進(jìn)行發(fā)作行為監(jiān)測。按照以上標(biāo)準(zhǔn),Ⅳ級(jí)以上發(fā)作為成功的癲癇自發(fā)發(fā)作模型。將成功的癲癇自發(fā)發(fā)作模型大鼠隨機(jī)分為5組,模型組(B)、丙戊酸鈉(VPA)組(C)、SSa低劑量組(D)、SSa中劑量組(E)、SSa高劑量組(F)。2.3給藥時(shí)間A組和B組均等容積生理鹽水ig給藥,C組丙戊酸鈉200mg·kg-1ig給藥,D~F組ipSSa0.54,1.09,2.18mg·kg-1,各組均連續(xù)給藥8周。2.4一般觀察2.5抗kt-lt-hrp的制備治療結(jié)束時(shí),每組隨機(jī)取3只大鼠,迅速麻醉后斷頭取腦,冰上分離海馬、顳葉皮層,放入-80℃低溫冰箱保存。蛋白裂解后,BCA法定量,制備SDS凝膠,加樣電泳,待溴酚藍(lán)電泳至分離底部時(shí)結(jié)束電泳。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,先將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉TBST封閉液中,置于水平搖床上,室溫封閉1h后用TBST清洗3次,每次5min。用TBST配制一抗(小鼠抗大鼠P糖蛋白1∶25),將PVDF膜放入已配好的抗體稀釋液中,4℃過夜,TBST清洗3次,每次10min。然后放入TBST配制HRP標(biāo)記的二抗,(羊抗小鼠IgG1∶2000),室溫1h。二抗孵育完后,TBST洗膜3次,每次10min。吸干多余的TBST,用BeyoECLplus發(fā)光液顯影(A液與B液1∶1配制),KodakImageStation2000MM成像系統(tǒng)采集圖像,用圖像處理軟件ImageTool3.0分析各蛋白帶的灰度值,用P-gp/β-actin代表蛋白條帶的灰度比值。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用表示。不同用藥組間比較采用單因素方差分析,組間比較采用LSD法。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1大鼠癲癇性發(fā)作情況在實(shí)驗(yàn)過程中,共對70只大鼠腹腔注射匹羅卡品制備難治性癲癇模型。其中5只大鼠反復(fù)給予匹羅卡品,始終無法誘發(fā)出SE,故棄用,其余65只大鼠在首次或追加匹羅卡品后開始出現(xiàn)癇性發(fā)作,并逐步達(dá)到SE。在急性期(24h)內(nèi),有9只大鼠因癲癇頻繁發(fā)作而死亡;在潛伏期(2周)內(nèi),因頻繁發(fā)作以及不能自主進(jìn)食衰竭死亡共8只,多在SE后一周死亡;在慢性期,存活的大鼠均出現(xiàn)自發(fā)發(fā)作,發(fā)作級(jí)別從Ⅰ級(jí)逐漸發(fā)展至Ⅴ級(jí),無致癇大鼠死亡。共有48只大鼠自發(fā)癇性發(fā)作達(dá)Ⅳ級(jí)或Ⅳ級(jí)以上為成功的難治性癲癇模型大鼠,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表選取其中30只進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。3.2統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)處理用藥前,各致癇組大鼠均表現(xiàn)Ⅳ級(jí)或Ⅴ級(jí)癇性發(fā)作,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;治療8周后,與模型組相比,VPA組及SSa低、中、高劑量組均可不同程度得減輕大鼠發(fā)作級(jí)別(P<0.05)。見表1。3.3ssa對海馬區(qū)p-gp表達(dá)的影響如表2所示,在大鼠海馬區(qū),Westernblotting檢測各組P-gp表達(dá)的灰度比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),給藥后VPA增強(qiáng)P-gp的表達(dá),SSa高劑量組可以降低海馬區(qū)P-gp的表達(dá),以高劑量組明顯(P<0.01);在大鼠顳葉皮層,P-gp表達(dá)的灰度比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),給藥后SSa低、中、高劑量均可以降低顳葉皮層P-gp蛋白的表達(dá),以高劑量組明顯(P<0.01)。4抗癲癇藥物作用近年來,多藥耐藥在難治性癲癇中所扮演的角色逐漸被認(rèn)識(shí),其中P-gp與難治性癲癇的關(guān)系研究相對較為深入。研究發(fā)現(xiàn)難治性癲癇患者腦內(nèi)特別是血腦屏障部位存在多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體和藥物靶酶的高表達(dá),參與了難治性癲癇的耐藥,其中研究最多的是P-gp,P-gp參與了癲癇耐藥的形成。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),P-gp廣泛存在于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腦實(shí)質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的足突。其能在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平調(diào)節(jié)藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)輸過程,在保持細(xì)胞內(nèi)外底物的濃度梯度、阻止底物進(jìn)入細(xì)胞起著重要的作用。當(dāng)P-gp與底物在胞膜內(nèi)側(cè)結(jié)構(gòu)結(jié)合時(shí),依靠ATP的轉(zhuǎn)化能量,P-gp像泵一樣將達(dá)到或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物或細(xì)胞毒性物質(zhì)泵出,降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度,減輕細(xì)胞毒作用,從而產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象,以致影響療效。癲癇發(fā)作后,P-gp在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞、大腦實(shí)質(zhì)和血管周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增加,這種增高是癇性發(fā)作誘導(dǎo)的。呂洋等用苯妥英鈉、苯巴比妥鈉、卡馬西平和丙戊酸鈉等抗癲癇藥物作用于體外培養(yǎng)腦星形膠質(zhì)細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)P-gp表達(dá)增強(qiáng),其變化與抗癲癇藥物的劑量和時(shí)間有關(guān),并隨著劑量增加及時(shí)間的延長呈一定正相關(guān)。提示P-gp表達(dá)增強(qiáng)也可能與抗癲癇藥物的誘導(dǎo)作用有關(guān)。Brandt等選擇一組苯巴比妥的耐藥鼠,同時(shí)聯(lián)合使用苯巴比妥及選擇性P-gp抑制劑,結(jié)果表明聯(lián)合用藥組極大的恢復(fù)了苯巴比妥的抗癲癇作用。目前P-gp表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚未清楚,研究發(fā)現(xiàn)癲癇組織內(nèi)的蛋白激酶C表達(dá)也隨之增高,考慮可能通過蛋白激酶C的信號(hào)傳導(dǎo)通路作用于MDR1基因,使MDR1轉(zhuǎn)錄和翻譯增加,上調(diào)P-gp的表達(dá)。匹魯卡品所致癲癇持續(xù)狀態(tài)SE后的慢性自發(fā)癲癇模型,是唯一與臨床最常見的成人癲癇病,即顳葉癲癇特征相一致的動(dòng)物模型,是目前國際上公認(rèn)的理想的顳葉癲癇動(dòng)物模型。難治性癲癇中約70%是顳葉癲癇,因此,匹魯卡品所致SE后的慢性自發(fā)性癲癇模型,是研究難治性癲癇較理想的模型。本課題組前期臨床研究表明,自擬方柴胡疏肝湯對癲癇發(fā)作有較好的臨床防治效果;實(shí)驗(yàn)研究表明,柴胡疏肝湯能減輕難治性癲癇大鼠的癲癇發(fā)作和降低P-gp的表達(dá),在此基礎(chǔ)上逐步篩選出君藥柴胡的有效成分SSa。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),SSa在抗最大電驚厥中起主要作用,并具有對抗小鼠戊四氮致癇作用,對小鼠強(qiáng)直性驚厥發(fā)生有較