蘇州大學(xué)研究生分子生物學(xué)考試答案完整版

一．名詞解釋1.移動(dòng)基因：又叫轉(zhuǎn)位因子（transposableelements）,由于它可以在染色體基因組上移動(dòng)，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱跳躍基因（jumpinggene）。2.斷裂基因（splitgene）：真核細(xì)胞的結(jié)構(gòu)基因，其核苷酸序列中含有與氨基酸編碼無關(guān)的DNA間隔區(qū)段，從而被分割成不連續(xù)的若干區(qū)域。將這種編碼序列不連續(xù)，有間隔區(qū)段的DNA片斷稱為斷裂基因。3.重疊基因（overlappinggenes）：不同基因的核苷酸序列有時(shí)為相鄰兩個(gè)基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個(gè)基因稱為重疊基因。4.假基因：在珠蛋白基因簇（genecluster）各片斷核苷酸序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了有正常的功能基因之外，還有功能失活的特殊序列片斷，它不能行使表達(dá)功能。該類無表達(dá)功能的畸變核苷酸基因序列片斷，稱為假基因。5.同尾酶：有一些限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別的堿基順序不完全恒定，即識(shí)別順序不同，但酶切后產(chǎn)生同樣黏性末端的兩種酶稱為同尾酶。6.質(zhì)粒：細(xì)菌中存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種獨(dú)立于染色體以外的遺傳成分，是由環(huán)狀的DNA分子組成的復(fù)制子?？梢栽诎麧{內(nèi)自主復(fù)制，把攜帶的遺傳信息通過自我復(fù)制的子代質(zhì)粒，可隨細(xì)菌分裂而進(jìn)入子代菌體中。7.柯斯（COS）質(zhì)粒：粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點(diǎn)和整個(gè)pBR322的DNA順序。經(jīng)感染進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞以后，它就好象質(zhì)粒那樣在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。分子量小，易環(huán)化和擴(kuò)增，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構(gòu)建基因文庫。8.COS細(xì)胞：用一個(gè)復(fù)制起始部位缺失的SV40突變種感染猴細(xì)胞，由于病毒DNA不能自主復(fù)制，便整合到宿主染色體DNA中，早期基因表達(dá)產(chǎn)生功能性的T抗原，這樣的細(xì)胞就叫COS細(xì)胞。9.基因組文庫：把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個(gè)受體菌克隆子群體中，這個(gè)群體即為這種生物的基因組文庫。10.cDNA文庫：以mRNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下將形成的互補(bǔ)DNA（cDNA）與某種載體相接，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，建立克隆株，即cDNA文庫（genelibrary）。11.轉(zhuǎn)化transformation：以質(zhì)粒作為克隆載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞。轉(zhuǎn)化作用就是一種基因型細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來自另一種基因型細(xì)胞的DNA，進(jìn)而使原來細(xì)胞的遺傳基因和遺傳性發(fā)生變化的現(xiàn)象。12.轉(zhuǎn)染：病毒（含噬菌體）DNA及其重組子DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（或細(xì)菌）的過程。由于噬菌體是細(xì)菌的病毒，因此噬菌體DNA導(dǎo)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞也稱轉(zhuǎn)染。13.轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程14.啟動(dòng)子：是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，是RNA聚合酶與模板DNA結(jié)合的部位。內(nèi)含保守序列。當(dāng)啟動(dòng)子與全酶結(jié)合后開始轉(zhuǎn)錄。15.起始密碼子：mRNA上的堿基順序每3個(gè)堿基用解讀框架劃分開，可決定其所生成蛋白質(zhì)的氨基酸順序，為了使堿基順序作為遺傳信息能正確轉(zhuǎn)譯，通常需要從某個(gè)特定的位置開始轉(zhuǎn)譯，這個(gè)起始點(diǎn)的密碼子就叫做起始密碼子。16.終止子：位于一個(gè)基因編碼區(qū)3’下游提供終止信號(hào)的DNA序列，可以被RNA聚合酶識(shí)別并發(fā)出停止mRNA合成的信號(hào)。一般為一段發(fā)卡結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列。17.粘性末端：是指DNA分子在限制酶切割后產(chǎn)生一條鏈多出幾個(gè)堿基的互補(bǔ)對稱的突出末端，若5’突出稱518、終止密碼子：有三個(gè)密碼子（UAA,UAG，UGA），是使蛋白質(zhì)合成終止的碼子，通過一個(gè)或兩個(gè)組合在一起發(fā)揮作用。只表示鏈的終止，不表達(dá)氨基酸。19.鋅指結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)半胱氨酸殘基和兩個(gè)組氨酸殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個(gè)穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu)，并以鋅輔基螯合成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為活性單位，在指狀突出區(qū)表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結(jié)合有關(guān)。20.載體（vector）：可以插入核酸片段、能攜帶外源核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在其中進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的自我復(fù)制的核酸分子。主要包括五類：質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生物(柯斯質(zhì)粒，單鏈DNA噬菌體M13)、動(dòng)物病毒。21.PCR.：聚合酶鏈反應(yīng)，是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件：模板DNA，寡鏈核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間等，使加入的4種dNTP由引物沿模板從5’→3’按堿基配對原則,形成與模板DNA互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。23.GenomicDNA：即基因組DNA，指組成生物基因組的所有DNA，包含一個(gè)生物體的全部遺傳信息，即DNA的全部核苷酸序列。24、Intron：即間隔子（內(nèi)含子），在轉(zhuǎn)錄后的加工中，從最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除去的內(nèi)部的核苷酸序列。也指編碼相應(yīng)RNA內(nèi)含子的DNA中的區(qū)域。內(nèi)含子對翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)無意義，它比外顯子累積有更多的突變。25、Exon：指真核細(xì)胞的基因在表達(dá)過程中能編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍會(huì)被保存下來，并可在蛋白質(zhì)生物合成過程中被表達(dá)為蛋白質(zhì)。外顯子是最后出現(xiàn)在成熟RNA中的基因序列,又稱表達(dá)序列。既存在于最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。27.轉(zhuǎn)錄（transcription）：生物體以DNA為模板在mRNA聚合酶的作用下，合成RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。包括轉(zhuǎn)錄起始、延伸、終止等過程。轉(zhuǎn)錄是不對稱的，體現(xiàn)為在DNA雙鏈上一股鏈可以轉(zhuǎn)錄而另一股不可以。二是模板鏈并不都是在同一單鏈上。28.翻譯（translation）：在多種因子輔助下，細(xì)胞內(nèi)以mRNA為模板，在核糖體上通過以tRNA識(shí)別mRNA的三聯(lián)體密碼子和轉(zhuǎn)移相應(yīng)氨基酸，組裝合成蛋白質(zhì)肽鏈的過程。29.順式作用元件：順式作用元件為一些能與DBP結(jié)合的特定序列DNA片段,主要位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。按功能可分為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、衰減子、終止子等DNA序列片段。30.反式作用因子：反式作用因子是一組能直接或間接地與DNA的順式作用元件特定序列結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的核內(nèi)非組蛋白，激活或阻遏基因表達(dá)。31.transcriptionfactor：即轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合在某基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，活化后從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至胞核，通過識(shí)別和結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件,啟動(dòng)和調(diào)控基因表達(dá)。32.瞬時(shí)表達(dá)：外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞后，不整合到受體細(xì)胞染色體而獨(dú)立于其外，隨復(fù)制而出現(xiàn)基因產(chǎn)物，但復(fù)制量不宜太多，否則會(huì)引起細(xì)胞死亡，也不能隨細(xì)胞傳代，因而其表達(dá)的量越來越少最后消失。這種現(xiàn)象稱為瞬時(shí)表達(dá)。33.穩(wěn)定表達(dá)：(1)外源基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞并整合入基因組后的表達(dá)。(2)基因工程表達(dá)系統(tǒng)中工程菌株或細(xì)胞雖經(jīng)過多次傳代或條件變化，但表達(dá)水平仍然保持穩(wěn)定的現(xiàn)象。。34.亮氨酸拉鏈：出現(xiàn)在DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)中的一種結(jié)構(gòu)基元。當(dāng)來自同一個(gè)或不同多肽鏈的兩個(gè)兩用性的α-螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸殘基）相互作用形成一個(gè)圈對圈的二聚體結(jié)構(gòu)時(shí)就形成了亮氨酸拉鏈35.基因突變：是基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變（通常它只涉及基因中部分序列的變化），并引起個(gè)體表型的改變,而使生物體發(fā)生遺傳性變異。36.無義突變：是指由于某個(gè)堿基的改變使代表某種氨基酸的密碼子突變?yōu)榻K止密碼子，從而使肽鏈合成提前終止。37.錯(cuò)義突變：是編碼某種氨基酸的密碼子經(jīng)堿基替換以后,變成編碼另一種氨基酸的密碼子,從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變。38.同義突變：堿基被替換之后,產(chǎn)生了新的密碼子，但由于生物的遺傳密碼子存在簡并現(xiàn)象,新舊密碼子仍是同義密碼子，所編碼的氨基酸種類保持不變。39.限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。主要從原核生物中分離純化出來。40.基因拼接：將有共同限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)的基因連接起來形成多種基因雜合體，如將IFN-1與IFN-2亞型間進(jìn)行拼接，可形成IFN-1/2或IFN-2/1等。41.基因缺失：有時(shí)為了提高表達(dá)效率及降低一些毒性作用，將原基因中的非功能區(qū)域的編碼子人為地使之缺失的過程稱為基因缺失。42、重組病毒載體：將外源性的DNA直接插入缺陷型的病毒基因組上，插入的外源片段的大小同被取代的病毒基因組區(qū)段是等同的。這樣形成的重組體DNA能夠在哺乳動(dòng)物的受納細(xì)胞中增殖，使用的病毒為病毒載體。43.重組質(zhì)粒型載體：即重組病毒-質(zhì)粒載體，這類載體只取病毒基因組中維持在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行復(fù)制的有關(guān)序列以及抗性標(biāo)記基因，使它與一個(gè)細(xì)菌質(zhì)粒融合，這樣的重組體也能夠在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制和增殖。44.基因工程多肽疫苗：使微生物對人體具保護(hù)作用的抗原基因經(jīng)體外重組表達(dá)后所制備的生物活性多肽類疫苗稱基因工程多肽或亞單位疫苗。45.基因置換(genereplacement)：指將致病基因整個(gè)地被有功能的正?；蛩脫Q，使致病基因永久地得到更正。46.基因修正(genecorrection)：指將致病基因的突變堿基序列得以糾正，而正常序列部分予以保留，使突變的致病基因恢復(fù)正常功能。47.基因修飾(geneaugmentation)：指將目的基因?qū)肴毕菁?xì)胞或其它細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物可修飾和改變?nèi)毕菁?xì)胞的功能或使原有的功能得到加強(qiáng)。48.基因失活(geneinactivation)：應(yīng)用反義技術(shù)特異封閉某些基因的表達(dá)，以達(dá)到抑制或阻止某些有害基因的表達(dá)49.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：就是把外源性目的基因?qū)雱?dòng)物的受精卵或其囊胚細(xì)胞中，并在細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細(xì)胞篩選出來，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動(dòng)物的子宮內(nèi),使之發(fā)育成具表達(dá)目的基因的胚胎動(dòng)物,并能傳給下一代。這樣，生育的動(dòng)物為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。50.動(dòng)物克隆：是一種通過核移植過程進(jìn)行無性繁殖的技術(shù)。取發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，使之與去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞融合，經(jīng)短期培養(yǎng)后形成胚胎細(xì)胞并移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)，就叫做動(dòng)物克隆。51.基因敲除：是向正常生物個(gè)體內(nèi)引入某個(gè)突變基因位點(diǎn)而選擇性地使某特定基因功能失活的技術(shù)。52.ES細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞，不僅具有全能分化能力，而且可以在體外培養(yǎng)建立細(xì)胞株。同時(shí)還有無限增殖和自我更新等功能。53.基因：是控制生物性狀的基本遺傳單位，是遺傳變異的主要物質(zhì)，支持著生命的基本構(gòu)造和性能。二．問答題1.什么叫基因？何謂基因的新概念？其主要功能是什么？答：基因就是指編碼有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必須的全部核酸序列。所謂基因的新概念是隨著近年分子生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)和功能，提出的移動(dòng)基因、斷裂基因、重疊基因、假基因等基因的新概念。功能：編碼蛋白質(zhì)或者RNA分子基本遺傳信息的基本遺傳單位是構(gòu)成DNA的功能單位。2.真核細(xì)胞基因組中的基因常有內(nèi)含子存在，能否在原核細(xì)胞中表達(dá)？能，為什么？不能，為什么？答：不能，真核細(xì)胞基因序列中的內(nèi)含子是插入在結(jié)構(gòu)基因中間使其不能連續(xù)的間隔基因序列片段，可隨DNA轉(zhuǎn)錄參與形成前體mRNA，而后剪切掉，在原核細(xì)胞中不包括這類內(nèi)含子，也缺乏相應(yīng)加工系統(tǒng)。因此不能完成內(nèi)含子基因序列的剪切過程。同時(shí)，真核生物基因在原核細(xì)胞中表達(dá)還必須有相應(yīng)的酶以及可識(shí)別的原核細(xì)胞的啟動(dòng)子,才能催化RNA的合成。3.試述DNA分子的結(jié)構(gòu)及其意義。答：DNA一級結(jié)構(gòu)：即DNA分子中脫氧核糖核苷酸的排列順序。意義：1、蘊(yùn)藏遺傳信息；2、決定著DNA的空間結(jié)構(gòu)及基因間相互作用和調(diào)控功能。DNA二級結(jié)構(gòu)：為DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，由兩條反向平行互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸鏈組成。意義：形成遺傳信息穩(wěn)定傳遞的半保留復(fù)制機(jī)制。DNA三級結(jié)構(gòu)，指雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的卷曲，包括超螺旋、多重螺旋等。意義：1、使DNA體積更小，2、超螺旋狀態(tài)儲(chǔ)存著必要的生物學(xué)過程的能量和信息。是一種重要的功能態(tài)。三鏈DNA：雙螺旋結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的三鏈螺旋結(jié)構(gòu)。意義：1、作為精確切割雙螺旋DNA靶序列的分子剪刀；2、作為基因表達(dá)抑制物，選擇阻斷靶基因，抑制轉(zhuǎn)錄；3、阻止序列專一性蛋白質(zhì)結(jié)合，影響DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合及DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄等。四鏈DNA：如端粒酶是真核細(xì)胞DNA3’4.試述cDNA文庫的構(gòu)建過程及其意義。答：過程：1、cDNA克隆：提取總RNA，用親和層析法獲取較純的mRNA。2、第一股cDNA合成：以分離純化的mRNA為模板，在引物與反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，沿模板的3’→5’方向合成。3、第二股cDNA的合成：⑴自身引導(dǎo)法⑵置換合成法⑶外加引物合成法4、cDNA與載體連接和導(dǎo)入宿主細(xì)胞：cDNA加頭或銜接尾，使產(chǎn)生的黏性末端與載體相應(yīng)的黏性末端互補(bǔ)，形成重組DNA。意義：1、cDNA無內(nèi)含子，大大減小其長度，便于操作。2、減少了篩選目的基因的工作量。3、利于獲得較多模板。4、可直接找到編碼區(qū)，推測氨基酸順序，分析性質(zhì)和功能。5、基因克隆后可在原核細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的蛋白。5.試述基因組文庫的構(gòu)建過程及其意義。答：：過程：（1）分離純化基因組DNA,提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體DNA；（2）制備全部基因組的DNA片斷。（3）構(gòu)建基因組文庫載體（4）DNA片段與載體的連接包裝（5）導(dǎo)入細(xì)胞，可用質(zhì)?；蛘呤删w意義：（1）可便于研究基因組中5’末端控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，內(nèi)含子的分布和作用以及重復(fù)序列的數(shù)量及分布的大小。（2）開展“人類基因組計(jì)劃”6.什么是限制性核酸內(nèi)切酶？答：限制性核酸內(nèi)切酶是一類可以識(shí)別雙鏈DNA的特異序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類限制酶。主要從原核生物中分離純化而來。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu),輔因子的作用方式，可將限制酶分為三種類型：I型、II型及III型。Ⅰ型既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型只催化非甲基化的DNA的水解；III型同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用。7.試述雙脫氧末端終止DNA測序法的原理及過程。答：原理：將2’，3’–雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3’–羥基，因此不能與下一位核苷酸反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應(yīng)將中止。過程：測序時(shí)分成四個(gè)反應(yīng),每個(gè)反應(yīng)除上述成分外分別加入2,3-雙脫氧的A,C,G,T核苷三磷酸,然后進(jìn)行聚合反應(yīng).在第一個(gè)反應(yīng)物中,ddATP會(huì)隨機(jī)地代替dATP參加反應(yīng)一旦ddATP加入了新合成的DNA鏈,由于其3位的羥基變成了氫,所以不能繼續(xù)延伸.所以第一個(gè)反應(yīng)中所產(chǎn)生的DNA鏈都是到A就終止了;同理第二個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生的都是以結(jié)尾的;第三個(gè)反應(yīng)的都以G結(jié)尾,第四個(gè)反應(yīng)的都以T結(jié)尾,電泳后就可以讀出序列了。8.試?yán)L圖并說明大引物PCR定點(diǎn)誘變法的過程。答：原理：以第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的引物。第一輪以引物2和引物3擴(kuò)增出短片段DNA，引物2含有預(yù)先設(shè)計(jì)的突變序列。待PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后除去原來的引物，然后以上一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為大引物，并與引物1一起再對靶基因作第二輪PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物即為突變的DNA。9.何謂基因工程的四大里程碑和三大技術(shù)發(fā)明？答：四大里程碑：1、肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，不僅證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA，而且還證明了DNA可以轉(zhuǎn)移，并把一個(gè)細(xì)胞的性狀傳遞給另一個(gè)細(xì)胞；2、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，建立了DNA半保留復(fù)制及蛋白質(zhì)合成的中心法則，提出了遺傳信息是DNA→RNA→蛋白質(zhì)，也闡明了轉(zhuǎn)錄翻譯過程中出現(xiàn)誤差造成生物變異；3、遺傳密碼子的破譯：提出操縱子學(xué)說，到完全破譯64個(gè)遺傳密碼子，確定遺傳信息是以密碼子方式傳遞的；4、基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)：20世紀(jì)60年代，發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的質(zhì)粒，它是指生物體染色體以外的環(huán)狀DNA，具有獨(dú)立自我復(fù)制的能力，可在微生物細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。三大技術(shù)發(fā)明：工具酶的發(fā)明（內(nèi)切酶、合成酶、連接酶）；基因合成和測序（合成儀、測序儀）；PCR技術(shù)（PCR擴(kuò)增儀）。10.基因工程常用的載體有哪些？其共同特性如何？答：常用載體的種類：質(zhì)粒、噬菌體衍生物（COS、M13）、動(dòng)物病毒；共同特征：①自主復(fù)制②易于擴(kuò)增分離純化③有非必需區(qū)④有單一酶切位點(diǎn)⑤有選擇標(biāo)記基因⑥表達(dá)載體還應(yīng)有表達(dá)調(diào)控元件11.作為理想質(zhì)粒載體的基本條件有哪些？答：作為理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備以下幾個(gè)條件1、能自主復(fù)制，即本身是復(fù)制子2、具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并在此位點(diǎn)中插入外源基因片段，不影響本身的復(fù)制功能（3）在基因組中有1-2個(gè)篩選標(biāo)記為寄主細(xì)胞提供易于檢測的表型特征（4）分子量要小，多拷貝，易于操作。12.什么叫插入失活，舉例說明之？答：外源基因片段克隆到插入型載體上后，會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)，也為克隆基因的選擇提供了表型。常用的有免疫功能失活和大腸桿菌-半乳糖甘酶失活。例一：免疫功能失活。Imm434是噬菌體434的免疫區(qū)段，通過噬菌體雜交的辦法導(dǎo)入噬菌體基因組，構(gòu)成插入型的派生載體。在CⅠ基因內(nèi)部有EcoRⅠ和HindⅢ的單一切割位點(diǎn)，若在這兩個(gè)位點(diǎn)中任意一個(gè)插入外源DNA片段，都會(huì)導(dǎo)致CⅠ基因的失活，阻遏蛋白合成受阻，進(jìn)入溶菌周期，結(jié)果產(chǎn)生出清晰的噬菌斑，而親本噬菌體CⅠ未失活，可以變成溶原的狀態(tài)，形成渾濁的噬菌斑。13.如何利用抗體標(biāo)記基因篩選陽性克?。看穑?、抗生素抗性標(biāo)記篩選：大多數(shù)質(zhì)粒載體均帶有抗生素抗性基因，如抗氨芐西林基因等，當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化抗性細(xì)胞后，所有轉(zhuǎn)入載體的細(xì)菌都獲得了抗性，被轉(zhuǎn)化的陽性克隆菌能在相應(yīng)抗生素的瓊脂平板上生長，而未被轉(zhuǎn)化的原宿主菌則不能生長。2、抗性基因的插入失活：在含有兩個(gè)抗性基因的載體中，如果目的基因DNA片段插入其中一個(gè)抗性基因，就會(huì)導(dǎo)致該抗性基因的功能失活，用兩個(gè)分別含不同抗生素藥物的平板進(jìn)行對照篩選，可篩選出陽性重組子克隆菌株。14.如何從所克隆到基因重組體中鑒定目的基因的存在和正確性？答：1、利用遺傳標(biāo)志的表型特征篩選：（1）由載體提供的性狀進(jìn)行篩選：a、抗生素抗性標(biāo)記篩選：當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化抗性細(xì)胞后，所有轉(zhuǎn)入載體的細(xì)菌都獲得了抗性，被轉(zhuǎn)化的陽性克隆菌，能在含相應(yīng)抗生素的平板上生長形成菌落，而未轉(zhuǎn)化的原宿主菌則不能生長。b、抗性基因的插入失活篩選：在含有兩個(gè)抗性基因的載體中，如果目的基因DNA片段插入其中一個(gè)抗性基因，就會(huì)導(dǎo)致抗性基因功能失活，用兩個(gè)含不同抗生素的平板進(jìn)行對照篩選。c、-半乳糖甘酶LacZ基因失活：通過基因內(nèi)互補(bǔ)作用，使缺失LacZ基因的突變體和帶有完整LacI而無-半乳糖甘酶活性的的突變體結(jié)合，形成有功能活性的-半乳糖甘酶。（2）根據(jù)插入基因的遺傳性狀進(jìn)行篩選：如亮氨酸（Leu）為Leu營養(yǎng)缺陷菌所必須，如果外源基因中能夠表達(dá)Leu，則可使細(xì)菌生長。2、根據(jù)重組子的結(jié)構(gòu)特征篩選：（1）重組子大小鑒別篩選：攜帶外源目的基因的重組子質(zhì)粒分量大，條帶滯后，反之在前。（2）酶切鑒定：原載體無外源目的片段，電泳為一條帶，裝有外源基因的載體有原載體和目的基因片段兩條帶。（3）PCR篩選法：利用能與插入基因片段兩端互補(bǔ)的特異引物，以少量抽提的重組子DNA為模板擴(kuò)增出特異片段的轉(zhuǎn)化子為攜有目的基因的重組子，還可進(jìn)行直接測序。（4）原位雜交：在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位置原位不變的轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位溶菌裂解，DNA變性和用特異探針進(jìn)行雜交。（5）斑點(diǎn)雜交：將重組體DNA或RNA提取出來，將樣品點(diǎn)在硝酸纖維膜上進(jìn)行雜交。純化的重組體去除了雜質(zhì)干擾。（6）Southernblot：將同源片段定位在某個(gè)酶切片段中，可用于對克隆后片段的基因定位，也可測其含量。15.質(zhì)粒單酶切點(diǎn)的基因連接缺點(diǎn)及如何降低本底和防止自我環(huán)化和提高連接效率？答：一般用細(xì)菌的或小牛腸的堿性磷酸酶，預(yù)先處理線性的載體DNA分子，以移去其末端的5’-P基團(tuán)，于是在連接反應(yīng)中，它自己的兩個(gè)末端就再也不能被連接酶共價(jià)連接起來了。這樣形成的雜種DNA分子的每一個(gè)連接位點(diǎn)中，載體DNA都只有一條鏈?zhǔn)峭庠碊NA連接上的，而另外一條鏈由于失去了5’-P基團(tuán)，不能作此連接，故留下一個(gè)具有3’-OH和516.真核表達(dá)調(diào)控的順式作用元件和反式作用因子有哪些？其作用特點(diǎn)是什么？答：順式作用元件有：啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，沉默子，衰減子，終止子。作用特點(diǎn)：1、多數(shù)位于真核生物結(jié)構(gòu)基因上游，只有終止子位于下游，而增強(qiáng)子可以在上游也可以在下游。2、能夠與DNA結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合的特定序列的DNA片段。3、決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。反式作用因子因子：通用轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。作用特點(diǎn)：1、同一DNA序列可被不同蛋白質(zhì)識(shí)別。2、不同蛋白質(zhì)因子可與不同DNA序列發(fā)生聯(lián)系，但直接連接為少數(shù)。3、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或DNA-蛋白質(zhì)的結(jié)合，均導(dǎo)致構(gòu)象上得細(xì)微變化，構(gòu)象變化常是實(shí)現(xiàn)調(diào)控功能的分子基礎(chǔ)。4、在反式作用因子的自身生物合成過程中，有相當(dāng)大的可變性和可塑性。17.目的基因表達(dá)系統(tǒng)有哪幾種？其特點(diǎn)如何？答：主要有原核和真核兩大表達(dá)系統(tǒng)。兩個(gè)系統(tǒng)的特點(diǎn)：1、真核生物DNA大部分是非裸露的，由核膜包裹，原核生物大部分DNA屬于非結(jié)合狀態(tài)，又無核膜相隔。2、真核生物DNA中存在內(nèi)含子，原核生物DNA序列中沒有內(nèi)含子。3、真核生物具有在需要時(shí)以可控方式重拍某些DNA片段和擴(kuò)增特定基因的機(jī)制，原核生物中罕見。4、真核生物有3種不同的RNA聚合酶，而原核生物往往只有一種。5、真核生物產(chǎn)生的mRNA分子壽命大多比原核生物長。6、真核生物初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的加工修飾。7、真核生物不存在操縱子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA為單順反子。原核基因表達(dá)調(diào)控順序?yàn)椴倏v子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子8、真核生物基因?yàn)槎嗫截?。而原核生物中除了rRNA，tRNA和啟動(dòng)子部分區(qū)域?yàn)橹貜?fù)序列，其余基因很少含重復(fù)序列。9、真核生物一條mRNA上同時(shí)只能合成一條肽鏈，原核生物每個(gè)核糖體可獨(dú)立合成一條肽鏈。10、真核生物翻譯過程不需要SD序列的特異性結(jié)合，原核生物必須依賴這種序列。11、原核生物表達(dá)的外源基因蛋白產(chǎn)物不能被糖基化。18.基因工程疫苗研究開發(fā)常用的途徑是什么？答：19.基因治療展望和應(yīng)用如何？答：展望：基因治療存在感染率低，表達(dá)水平低，長期表達(dá)效果難，整合隨機(jī)性帶來危害等自身問題，以及倫理道德，安全性，技術(shù)復(fù)雜，要求條件高，所用細(xì)胞壽命短等技術(shù)問題。但它是人類治療疑難疾病的新方法，新技術(shù)，隨著研究和應(yīng)用的不斷發(fā)展，不斷深入，技術(shù)不斷完善成熟，基因治療將會(huì)在人類常見病和多發(fā)病及疑難病的有效治療中發(fā)揮巨大作用，許多原來視為“不治之癥”的疾病將應(yīng)用這先進(jìn)技術(shù)得到治愈，其應(yīng)用前景極為廣闊。應(yīng)用：1、遺傳性疾病的基因治療2、腫瘤的基因治療（1）抑癌基因轉(zhuǎn)移的基因治療（2）反義寡核苷酸的原癌基因失活療法（3）藥物自殺基因在腫瘤基因治療中的應(yīng)用（4）癌抗原基因轉(zhuǎn)移的腫瘤基因治療（5）多重耐藥性基因轉(zhuǎn)移的腫瘤基因治療3、病毒的基因治療（1）阻止病毒復(fù)制策略（2）使感染HIV細(xì)胞死亡的方法（3）降解策略20有哪幾種反義核苷酸基因失活療法？簡述其原理。答：原理：反義RNA是一種與mRNA互補(bǔ)的RNA分子，它是雙鏈DNA中無意義鏈轉(zhuǎn)錄的RNA，因此腫瘤癌基因活化表達(dá)的mRNA的起始翻譯部位就會(huì)被相應(yīng)的反義RNA互補(bǔ)結(jié)合形成RNA/RNA雙鏈體，進(jìn)而就阻止了核糖體與啟動(dòng)子結(jié)合，或阻止核糖體mRNA上移，以抑制mRNA的翻譯，起到了抑制癌基因過高表達(dá)癌蛋白的效果。反義核酸包括三類：1、將特異的反義基因重組到表達(dá)載體上，導(dǎo)入靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出反義RNA。2、人工合成寡聚脫氧核糖核酸經(jīng)過化學(xué)修飾導(dǎo)入細(xì)胞，與mRNA和DNA結(jié)合，形成DNA核苷酸三聚體。3、特異性的核酸，根據(jù)癌基因設(shè)計(jì)出特異的“錘頭”或“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，它能夠催化切割，降解異常表達(dá)基因的mRNA而影響基因的翻譯。21.何謂動(dòng)物克隆技術(shù)？有何應(yīng)用價(jià)值？答：動(dòng)物克?。菏且环N通過核移植過程進(jìn)行無性繁殖的技術(shù)。取發(fā)育早期的動(dòng)物胚胎細(xì)胞，或成年動(dòng)物的體細(xì)胞，使之與去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞融合，經(jīng)短期培養(yǎng)后形成胚胎細(xì)胞并移植到生殖周期相近的母體之中，可以發(fā)育成為正常動(dòng)物個(gè)體。經(jīng)過核移植而產(chǎn)生的動(dòng)物，其遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體完全相同。這種不經(jīng)過有性生殖過程，而是通過核移植生產(chǎn)遺傳結(jié)構(gòu)與細(xì)胞核供體相同動(dòng)物個(gè)體的技術(shù)，就叫做動(dòng)物克隆。應(yīng)用價(jià)值：1、培育優(yōu)良畜種和生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。3、生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞用于細(xì)胞和組織替代療法。4、復(fù)制瀕危動(dòng)物物種，保存?zhèn)鞑?dòng)物物種資源。22.試述PCR的原理及過程。答：原理：是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，在試管中給DNA的體外合成提供一種合適條件：模板DNA，寡鏈核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖液系統(tǒng)和DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間等，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其技術(shù)原理如圖：P135PCR過程：1、DNA模板變性：與體內(nèi)不同，體外用94C左右的高溫使其變性形成單鏈DNA。2、模板與引物退火：PCR需要兩條寡鏈核苷酸作為合成時(shí)的引物，分別與待擴(kuò)增DNA的序列兩端互補(bǔ)。在降低溫度過程中，通過控制退火條件就能使其與擴(kuò)增區(qū)域兩端配對。3、引物延伸：在4種dNTP及Mg離子存在的條件下，DNA聚合酶在最適作用溫度下可將核苷酸從引物323.試述RT-PCR的原理及過程。答：原理：即逆轉(zhuǎn)錄PCR，先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下以mRNA為模板合成DNA,再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。這樣低濃度的mRNA被擴(kuò)增放大易于檢測。是一種快速、簡便且敏感性極高的檢測RNA的方法，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、克隆cDNA及合成cDNA探針、改造cDNA序列等。RT-PCR過程：1、mRNA，引物和逆轉(zhuǎn)錄酶以及適當(dāng)?shù)木彌_體系在70C5min，生成相應(yīng)的cDNA。2、dNTP，DNA聚合酶，引物，適當(dāng)?shù)木彌_體系，37C1h，而后9524試述腫瘤的發(fā)生機(jī)理。答：1、癌基因（原癌基因）的異常表達(dá)。2、抑癌基因的失活，會(huì)對癌基因的異常表達(dá)失去抑制作用。3細(xì)胞在增殖過程由于某些因素使DNA在復(fù)制過程中產(chǎn)生堿基錯(cuò)配的基因，由于細(xì)胞DNA修復(fù)功能的喪失而無法得到校正。4腫瘤轉(zhuǎn)移基因和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因相互制約的關(guān)系發(fā)生失調(diào)或障礙。5腫瘤細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱也與腫瘤的發(fā)生相關(guān)。25.試述腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期調(diào)控的相關(guān)性.答：細(xì)胞周期素和CDK等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白過表達(dá)或者缺陷，特別是那些決定細(xì)胞有G1進(jìn)入S期的蛋白若表達(dá)異常，使細(xì)胞周期進(jìn)程超越或突破細(xì)胞周期的控制點(diǎn)，細(xì)胞不能正常發(fā)生細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的細(xì)胞死亡，衰老或分化，從而造成細(xì)胞惡性增生，形成惡性腫瘤。P53，Rb等抑癌基因的突變或缺失，與許多惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展和不良預(yù)后相關(guān)，如某些生長因子及其受體的高表達(dá)與癌基因異常激活有關(guān)，特別是一些與