乳腺癌bcml-a349生物學(xué)特性及基因表達(dá)的研究

乳腺癌bcml-a349生物學(xué)特性及基因表達(dá)的研究

根據(jù)建立了人類卵巢細(xì)胞移植模型和ta2個(gè)社區(qū)（b-淋巴結(jié)移植模型）對(duì)大鼠進(jìn)行了成功的移植，并對(duì)不同類型的小鼠進(jìn)行了分類。在那之后，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)幾乎是同一世代的小鼠。移植成活率為100%，自發(fā)肺轉(zhuǎn)移率為55.84%，沒(méi)有自發(fā)退化?，F(xiàn)將本模型的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移中某些生物學(xué)特性、組織學(xué)特性的結(jié)果報(bào)告如下。1材料和方法1.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)源TA2近交系鼠引自天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物室。本院動(dòng)物室自行繁育。1.2實(shí)驗(yàn)方法采用實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤傳統(tǒng)的接種方法。將實(shí)體瘤組織在超凈臺(tái)內(nèi)剪切成2mm3小塊，分別移植于左側(cè)乳腺區(qū)域。1.3瘤組織原位移植1999年8月17日發(fā)現(xiàn)1只263天雌性TA2小鼠左下腹乳腺區(qū)域一2.5cm×2cm腫物，在無(wú)菌條件下拉頸處死后剖檢發(fā)現(xiàn)，左下腹乳腺區(qū)腫物與皮膚緊密粘連，剖開瘤組織部分實(shí)性區(qū)，部分囊性區(qū)，囊性區(qū)內(nèi)含大量陳舊性咖啡色液體，與腹側(cè)相鄰區(qū)的瘤組織可見少許好的瘤組織。剖開胸腔發(fā)現(xiàn)肺部布滿白色半透明狀小結(jié)節(jié)，未查見胸、腹水（圖1），取肺部轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)，按常規(guī)制成2mm3小塊，移植于5只8周齡同系小鼠左側(cè)下腹乳腺區(qū)域，每只2塊。移植后第5天5只小鼠移植區(qū)出現(xiàn)瘤結(jié)，除1只荷瘤鼠作為鼠間傳代，余4只鼠移植后第68天發(fā)現(xiàn)有肺轉(zhuǎn)移（3/4）。以后鼠間移植均用原位移植的瘤組織進(jìn)行連續(xù)原位移植傳代。原發(fā)瘤與移植瘤經(jīng)病理學(xué)檢查，屬小鼠乳腺癌A型，伴肺轉(zhuǎn)移。2結(jié)果2.1規(guī)接種條件下的生存時(shí)間移植成活率為100%(218/218），潛伏期平均為4.78±0.49天，在常規(guī)接種條件下（小塊法）1～19代，存活時(shí)間18～81天，平均為57.71±13.83天，中位存活時(shí)間52天；20～41代存活時(shí)間22～67天，平均為58.8±10.03天，中位存活時(shí)間51天。自發(fā)肺轉(zhuǎn)移率達(dá)55.84%(86只/154只）。2.2小鼠肺轉(zhuǎn)移損傷內(nèi)等途徑，主要分為3個(gè)外科瘤，2對(duì)76只小鼠采用乳腺原位、腹側(cè)、腹股溝、腳墊皮下及肌肉內(nèi)、尾靜脈、眼球后靜脈叢內(nèi)等途徑，用同一瘤源分別用瘤組織小塊（0.2cm）和瘤細(xì)胞懸液（1×106）移植，結(jié)果上述途徑均能使小鼠局部皮下形成實(shí)體瘤，并不同程度發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。而眼球后靜脈叢、尾靜脈、腳墊皮下注射瘤細(xì)胞后100%發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。各部位移植后的存活時(shí)間見表1。2.3荷瘤小鼠生物學(xué)特性將第26代10只荷瘤鼠長(zhǎng)期觀察，接種局部可觸及瘤結(jié)時(shí)，記錄潛伏期；每日用游標(biāo)卡尺檢測(cè)腫瘤的長(zhǎng)、寬各徑，按公式V=D1×D2π/6計(jì)算腫瘤體積，為了計(jì)算腫瘤的倍增時(shí)間（Td），采用指數(shù)函數(shù)計(jì)算生長(zhǎng)率R=R(InNt-InNo）/t（其中No為瘤體積初始值，Nt為經(jīng)過(guò)t時(shí)間后的體積）；然后計(jì)算倍增時(shí)間：Td=Tn2/n。第26代的生長(zhǎng)曲線（圖2）顯示了該腫瘤生長(zhǎng)呈現(xiàn)四個(gè)階段：第一階段為潛伏期（1～5天）；第二階段為緩慢生長(zhǎng)期（6～10天）；第三階段為指數(shù)生長(zhǎng)期（11～20天）；此時(shí)的倍增時(shí)間為3.11天；第四階段為生長(zhǎng)穩(wěn)定期（20～32天），因腫瘤的生長(zhǎng)已達(dá)到一定的體積與時(shí)限，生長(zhǎng)速度減慢，此時(shí)的倍增時(shí)間為4.30天。荷瘤小鼠在生存后期出現(xiàn)厭食、體弱、皮毛蓬松、瘤結(jié)出現(xiàn)破潰，中心可見壞死區(qū)域。存活時(shí)間22～61天。除1只荷瘤鼠用于鼠間傳代外，余9只荷瘤鼠5只伴肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率55.55%，其中4只伴胸、腹水。2.4細(xì)胞染色體分析分別取第21、27、29、30代的移植瘤快速生長(zhǎng)期（15、20天）荷瘤小鼠進(jìn)行染色體分析，現(xiàn)將荷瘤小鼠的實(shí)體瘤組織在無(wú)菌條件下制備成單細(xì)胞，加0.1%秋水仙素10μg/ml，置37℃恒溫箱培養(yǎng)，3h后腹水。采集分裂細(xì)胞、低滲、固定和制片。Giemsa染色計(jì)數(shù)移植瘤的100個(gè)中期細(xì)胞染色體數(shù)，鏡檢。分析結(jié)果顯示：該模型的細(xì)胞染色體為端著絲點(diǎn)，屬鼠類染色體。染色體分布范圍為74～132，其中三倍體及超三倍體占20%，四倍體及超四倍體占40%，亞四倍體占32%?？梢姳姅?shù)細(xì)胞染色體多數(shù)多倍體為主。2.5小鼠骨髓涂片觀察取第5、10、15、19、20、24、28、30代快速生長(zhǎng)期及病危期荷瘤小鼠的血涂片及長(zhǎng)骨進(jìn)行骨髓涂片觀察，結(jié)果：早期未見癌細(xì)胞。荷瘤晚期可查見癌細(xì)胞，表明該模型晚期具有血道轉(zhuǎn)移并累及造血系統(tǒng)。2.6dna的測(cè)定采用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特EPICS-XL型流式細(xì)胞儀分別對(duì)移植瘤10、26、35代瘤組織進(jìn)行DNA測(cè)定，用美國(guó)Multicycle軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均為異倍體細(xì)胞。10代為19.4;26代為28.0;35代為23.7。2.7cerbc-2在組織中的表達(dá)取各代移植及伴肺轉(zhuǎn)移病灶的組織，用免疫組織化學(xué)方法SASP法觀察p53、nm23、cerbB-2在組織中的表達(dá)和分布情況，并與原代瘤作對(duì)照。結(jié)果顯示各代移植及轉(zhuǎn)移至肺的瘤組織中p53、cerbB-2呈陽(yáng)性表達(dá)，與原發(fā)瘤保持結(jié)果一致（圖10～12);nm23在移植瘤的早期呈陽(yáng)性表達(dá)，而荷瘤晚期呈陰性不表達(dá)狀態(tài)。2.8分組和給藥時(shí)間為了觀察BCML-TA299對(duì)化療藥物的敏感性，采用乳腺癌臨床常用的和實(shí)驗(yàn)室已知的具有抗癌作用的各類聯(lián)合化療方案進(jìn)行療效觀察。用第44代瘤源，按常規(guī)小塊方法行同系鼠乳腺原位移植，接種后待腫瘤長(zhǎng)至1cm×0.8cm左右時(shí)（第18天），將荷瘤小鼠隨機(jī)分成給藥組和對(duì)照組，各藥物劑量參照《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》計(jì)算所得相同水平，按臨床給藥時(shí)間給藥。療效評(píng)價(jià)：治療組在給藥前與給藥后均測(cè)量各組的腫瘤體積，比較給藥組與對(duì)照組腫瘤平均體積的差異，按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率：實(shí)驗(yàn)結(jié)果：BCML-TA299對(duì)7種已知抗癌藥物方案的初步試驗(yàn)結(jié)果表明：它對(duì)CAP(CTX、ADM、DDP）、GAT（健擇、ADM、紫杉醇）、TA（紫杉醇、ADM）、NP(NVB、DDP）、CMF(CTX、MTX、5-FU）、CAF(CTX、ADM、5-FU）、T（紫杉醇）均有不同程度的敏感性，其中對(duì)CAP的作用最為顯著，而單藥紫杉醇作用最差。見表2。3肺轉(zhuǎn)移灶bcml-ta299原位移植模型及生物學(xué)意義已知哺乳類動(dòng)物惡性腫瘤與人類惡性腫瘤的發(fā)生部分組織學(xué)類型，以及轉(zhuǎn)移途徑和方式均類似，因此應(yīng)用哺乳類動(dòng)物的可移植性腫瘤研究機(jī)制，是我們常用的材料及手段。有關(guān)動(dòng)物乳腺癌模型建立國(guó)內(nèi)高進(jìn)教授1996年進(jìn)行了系統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)，共計(jì)17個(gè)乳腺癌模型，伴有轉(zhuǎn)移行為有8個(gè)（其中A型2個(gè)，B型13個(gè)，乳頭狀癌，梭型細(xì)胞癌各1個(gè)）。但迄今為止，小鼠乳腺癌行原位移植并具有轉(zhuǎn)移，保持穩(wěn)定的模型尚屬少見。移植瘤在轉(zhuǎn)移過(guò)程中經(jīng)歷了局部細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、遠(yuǎn)處器官再生長(zhǎng)程序，包括了癌細(xì)胞首先侵襲至臨近組織穿過(guò)脈管進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)細(xì)胞附著、增殖一系列復(fù)雜步驟。我們利用TA2系小鼠體內(nèi)成功地建立了BCML-TA299可移植性模型，完整地實(shí)現(xiàn)了乳腺癌細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)及肺轉(zhuǎn)移的病理過(guò)程。其侵襲和轉(zhuǎn)移途徑是：1）移植瘤在同系鼠乳腺原位呈廣泛的侵襲性生長(zhǎng)、成瘤；2）經(jīng)局部微血管至體循環(huán)轉(zhuǎn)移到肺，形成了多個(gè)轉(zhuǎn)移灶；3）荷瘤晚期并發(fā)血性胸腹水。上述結(jié)果符合乳腺癌在人體內(nèi)血行轉(zhuǎn)移規(guī)律。本研究結(jié)果表明，BCML-TA299原位移植模型，經(jīng)過(guò)兩年多的鼠間連續(xù)傳代，不僅轉(zhuǎn)移模式與臨床患者相似，而且在組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)上與人乳腺癌有相同的特征，來(lái)自于乳腺上皮細(xì)胞，并具有廣泛侵襲周圍組織，自發(fā)的肺轉(zhuǎn)移的特征不變，說(shuō)明了我們建立的這株TA2系小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移模型（BCML-TA299）生物學(xué)特點(diǎn)是穩(wěn)定的。經(jīng)鼠間傳代各代移植瘤與原發(fā)瘤比較仍保持原發(fā)瘤病理形態(tài)學(xué)特征。通過(guò)各代染色體觀察分析，該模型基本是一個(gè)多數(shù)多倍體的細(xì)胞，具有惡性腫瘤的染色體特征。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)原發(fā)瘤與鼠間移植瘤DNA倍體均為異倍體。腫瘤的倍增時(shí)間是研究增殖動(dòng)力學(xué)的重要項(xiàng)目之一，從我們建立的可移植性小鼠乳腺癌模型生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)觀察，腫瘤倍增時(shí)間（在快速生長(zhǎng)期）定為3.11天，此時(shí)期瘤體積增大，以瘤細(xì)胞異常增殖所致，符合腫瘤的生物學(xué)特性。腫瘤的發(fā)生發(fā)展本質(zhì)上是細(xì)胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活造成的。有關(guān)基因和抑癌基因的研究對(duì)探討腫瘤發(fā)病機(jī)制，尋找預(yù)防和治療的新措施具有重要意義。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)、免疫組織化學(xué)方法，我們系統(tǒng)地檢測(cè)了BCML-TA299同系鼠間傳代及各代原發(fā)瘤與轉(zhuǎn)移瘤p53、c-erbB-2、nm23產(chǎn)物蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該模型具有p53突變及c-erbB-2基因異常表達(dá)，轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)與原發(fā)灶的p53、c-erbB-2基因表達(dá)水平結(jié)果一致，說(shuō)明原發(fā)灶的細(xì)胞與肺轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞具有相同的生物異質(zhì)性。nm23在移植瘤的早期呈陽(yáng)性表達(dá)，而到荷瘤晚期是不表達(dá)狀態(tài)。上述結(jié)果提示在維持腫瘤細(xì)胞惡性表型上p53突變與c-erbB-2基因的活化起重要作用，與該模型腫瘤細(xì)胞分化差、生長(zhǎng)倍增速度快，細(xì)胞之間粘附性差，細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的生物異質(zhì)性與轉(zhuǎn)移能力受多因素支配。初步藥物療效結(jié)果表明，BCML-TA299對(duì)抗癌藥物的敏感性比較廣泛，其中CAP顯示出對(duì)BCML-TA299乳腺癌有明顯的抑制作用，關(guān)于抗腫瘤藥物對(duì)BCML-TA299作用機(jī)制有待進(jìn)一步深