重組人白介素-8誘導(dǎo)表達(dá)

高朝輝重組人白介素-18誘導(dǎo)表達(dá),純化與免疫印跡鑒定藥用蛋白的基因工程路線獲得目的基因→質(zhì)粒重組→構(gòu)建工程菌→目的蛋白表達(dá)→純化蛋白→免疫印跡→生物活性測(cè)定→藥理活性→藥劑學(xué)→臨床應(yīng)用CompanyLogo實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線誘導(dǎo)培養(yǎng)→細(xì)胞破碎→電泳檢驗(yàn)→純化蛋白→轉(zhuǎn)膜反應(yīng)→免疫鑒定→顯色反應(yīng)CompanyLogo誘導(dǎo)培養(yǎng)取2mL種子液接入100mL培養(yǎng)液，加入Amp(100mg/mL)至終濃度50ug/mL，在250ml搖瓶中于37℃劇烈培養(yǎng)1h。吸出1mL未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物放在一個(gè)Ep管中，按下面步驟5和6所述進(jìn)行處理。在剩余培養(yǎng)物中加入IPTG（100mmol/L）至終濃度1mmol/L，37℃繼續(xù)通氣培養(yǎng)。在誘導(dǎo)的不同時(shí)間（如0.5、1、1.5、2和3）取1mL樣品放于Ep管中，室溫高速（12000rpm）離心2min。沉淀懸于100uL的1×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水浴加熱5min，點(diǎn)動(dòng)離心，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。CompanyLogo細(xì)胞破碎培養(yǎng)到3h后，收集剩余培養(yǎng)物，于4℃下4000rpm離心10min，倒置離心管，盡量去掉上清培養(yǎng)液。用10ml去離子水重懸菌體。超聲破碎細(xì)胞，儀器設(shè)置：功率600W、破碎5s，空閑5s，重復(fù)200次、冰浴試管，在超聲破碎的時(shí)候始終保持低溫。4℃下4000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，用10mL去離子水重懸沉淀，取50ul沉淀重懸液留樣。4℃下10000rpm離心20min，將上清液經(jīng)0.45um的濾膜，去除細(xì)胞碎片，將過(guò)濾液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，儲(chǔ)存于4℃冰箱待用，取50uL上清液留樣。用10ml去離子水重懸沉淀，取50uL重懸液留樣。CompanyLogo純化蛋白用結(jié)合緩沖液平衡5個(gè)柱床體積，流速2ml/min。將10mL上清液上樣，流速為1mL/min，用另一離心管承接樣品，反復(fù)上樣1h，取最終流出液體50ul留樣。用結(jié)合緩沖液再洗5個(gè)柱床體積，流速2ml/min。用25mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，收集洗脫峰50ul留樣。用50mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，收集洗脫峰50ul留樣。用100mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，收集洗脫峰50ul留樣。CompanyLogo用300mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，收集洗脫峰50ul留樣。用400mmol/L的咪唑洗脫液洗脫，洗脫5個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，收集洗脫峰50ul留樣。將所有留樣樣品內(nèi)加入50uL的2×SDS凝膠加樣緩沖液，混合，沸水浴加熱5min，點(diǎn)動(dòng)離心，準(zhǔn)備上樣。用去離子水洗5個(gè)柱床體積，再用20％乙醇洗3個(gè)柱床體積，流速為2mL/min，將柱子封存于4℃冰箱保存。CompanyLogo電泳檢驗(yàn)?zāi)z配方(單板凝膠)凝膠點(diǎn)樣去離子水丙烯酰胺Tris溶液10%SDS10%APTEMED10%分離膠2.61.7pH8.8:0.60.050.050.0035%濃縮膠1.70.5pH6.8:0.760.020.020.003第一道第二道第三道第四道第五道第六道第七道第八道第九道第十道凝膠1Marker空菌空質(zhì)粒誘導(dǎo)0h誘導(dǎo)0.5h誘導(dǎo)1h誘導(dǎo)2h誘導(dǎo)3h誘導(dǎo)4h標(biāo)準(zhǔn)凝膠2Marker沉淀包涵體二次沉上清穿透（清液）2550100300400CompanyLogo轉(zhuǎn)膜反應(yīng)取純化的目的蛋白上樣20ul，電泳上樣，120V，電泳1h，停止電泳。要先將玻璃板撬掉才可以剝膠，將濃縮膠輕輕刮去，最后將溴酚藍(lán)的前沿切下。將取下的凝膠放入轉(zhuǎn)移緩沖液中，浸泡15min。按照取下凝膠的大小，剪取等大的硝酸纖維素膜，也浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中15min。將凝膠與硝酸纖維素膜重合，在左上角剪個(gè)小口做標(biāo)記。再剪取同樣大小的兩張厚濾紙，使用之前要在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡一下，濾紙不要比凝膠和膜大，以免短路。CompanyLogo將轉(zhuǎn)移電泳槽中的夾子打開(kāi)，也浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中。白色一面在底下，在上面墊一張海綿墊，用玻璃棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡，在墊子上墊濾紙，一手固定濾紙，一手用玻璃棒搟去其中的氣泡。接著放上硝酸纖維素膜，再放上凝膠，凝膠之上再放濾紙。濾紙，膜，凝膠和濾紙之間要對(duì)整齊。最后蓋上另一個(gè)海綿墊，搟幾下就可以合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移緩沖液中進(jìn)行。將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，要使夾子的黑面對(duì)應(yīng)陰極，夾子的白面對(duì)應(yīng)陽(yáng)極。電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，將轉(zhuǎn)移電泳槽下端接上自來(lái)水，冷凝循環(huán)。打開(kāi)電源，200mA，1.5h。CompanyLogo將硝酸纖維素膜取出放在平皿中，加入適量麗春紅染色液，在搖床上染色5分鐘，后用流水沖掉染液。觀察現(xiàn)象。CompanyLogo免疫反應(yīng)將膜用TBST浸濕后，移至含有封閉液的表面皿中，室溫下，用封閉液在搖床上搖動(dòng)封閉過(guò)夜（正面朝上）。從封閉液中取出膜，在含有TBST的表面皿中洗滌5min，反復(fù)3次。將膜（正面朝上）放入含有一抗的自封袋中，放入37℃搖床溫育1h。從封閉袋中取出膜，在含有TBST的表面皿中洗滌5min，反復(fù)3次。將膜（正面朝上）放入含有二抗的自封袋中，放入37℃搖床溫育1h從封閉袋中取出膜，