第四章 植物組織培養(yǎng)拓展技術(shù)

第4章植物組織培養(yǎng)拓展技術(shù)4.1細胞培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)是將從植物的培養(yǎng)物游離的細胞或細胞團，在人工培養(yǎng)基上進行的培養(yǎng)的方法。通過細胞繼代培養(yǎng)，使細胞不斷增殖，還能使高等植物的單個細胞經(jīng)過離體培養(yǎng)后細胞分裂形成細胞團，再經(jīng)過細胞分化最后產(chǎn)生完整的植株。

4.1.1單細胞的分離4.1.1.1機械分離

先將植物葉片取下經(jīng)過無菌處理后，在研缽中輕輕研碎，經(jīng)過一定孔徑的紗布或不繡鋼濾網(wǎng)過濾，取出過濾后的研磨介質(zhì)經(jīng)過低速離心等其他處理使細胞得到純化。

4.1.1.2酶解分離

用纖維素酶和果膠酶等酶液處理適合植物外植體即可得到所需要的單細胞。

4.1.1.3由組織培養(yǎng)物分離

離體培養(yǎng)的愈傷組織分離單細胞。

機械分離法和酶解分離法的比較機械法酶解法細胞受到酶的傷害；要質(zhì)壁分離；細胞產(chǎn)量高；細胞不易破。細胞不受到酶的傷害；機械法不用質(zhì)壁分離；細胞產(chǎn)量低；細胞易破。4.1.2單細胞的培養(yǎng)

4.1.2.1看護培養(yǎng)法含義：用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。用途：誘導(dǎo)形成單細胞系。

要求：看護愈傷組織處于活躍生長狀態(tài)；愈傷組織和所要培養(yǎng)的細胞可以是同一個物種也可以不同。看護培養(yǎng)的方法（1）在一個培養(yǎng)瓶中加入一定量厚的固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。（2）無菌條件下，將一小塊活躍生長的愈傷組織接種到培養(yǎng)基上，再在愈傷組織塊上放一片已滅菌的濾紙，然后放置一個晚上。（3）將分離的單個細胞接種到培養(yǎng)基的濾紙上。（4）恒溫培養(yǎng)。4.1.2.2微室培養(yǎng)法含義：人工制造一個小室，將單細胞接種在小室的微量培養(yǎng)基中。用途：主要用來觀察細胞生長、分裂、形成細胞團的過程。特點：在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)進行顯微觀察，將一個細胞的生長、分裂和形成細胞團的全部過程記錄下來。微室培養(yǎng)的方法

先將先由愈傷組織培養(yǎng)誘導(dǎo)，經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)制得單細胞懸浮液備用。在無菌條件下，按蓋玻片大小在無菌載玻片上涂一圈四環(huán)素眼藥膏。將制得的單細胞懸浮液中取出一滴3ml只含一個單細胞的培養(yǎng)液，滴在圈內(nèi)的載玻片上，然后在藥膏上放一小段已消毒的毛細玻璃管，將無菌蓋玻片蓋在涂有一圈藥膏的載玻片上，輕壓使其與藥膏緊密接觸，使蓋玻片與載玻片之造成一密封的小室。

4.1.2.3平板培養(yǎng)法含義：把單個細胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層(1mm)在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。用途：是為了分離單細胞無性系，研究其生理、生化的遺傳上的差異而設(shè)計的一種單細胞培養(yǎng)技術(shù)。廣泛應(yīng)用于細胞、原生質(zhì)體及融合產(chǎn)物的培養(yǎng)。特點：可以定點觀察；分離單細胞系比液體淺層培養(yǎng)容易；培養(yǎng)細胞氣體交換不暢。4.1.3細胞懸浮培養(yǎng)

細胞懸浮培養(yǎng)是將游離細胞或細胞團按一定密度，懸浮在液體培養(yǎng)基中不斷地攪拌或振蕩培養(yǎng)，可以使培養(yǎng)細胞快速大量增殖。

4.1.3.1分批培養(yǎng)

含義：分批培養(yǎng)是指將一定量的細胞或細胞團分散在一定量的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

目的：建立單細胞培養(yǎng)物。4.1.3.2連續(xù)培養(yǎng)

含義：連續(xù)培養(yǎng)過程中，不斷注入新鮮培養(yǎng)基，排掉等體積的用過的培養(yǎng)基，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)得到不斷補充。

目的：連續(xù)培養(yǎng)是植物細胞培養(yǎng)技術(shù)中的一項重要進展，它對于植物細胞代謝調(diào)節(jié)的研究，對于決定各個生長限制因子對細胞生長的影響，特別是對于次生物質(zhì)的大量生產(chǎn)等具有一定意義。

4.1.3.3細胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用懸浮培養(yǎng)的單細胞系是突變體育種的良好材料；人工種子和快速繁殖上的應(yīng)用；種質(zhì)保存當(dāng)中的應(yīng)用；遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用；工業(yè)方面一是生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物，二是用于生物轉(zhuǎn)化，得到期望的天然化合物。4.2原生質(zhì)體培養(yǎng)

原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義：

（1）在植物遺傳育種實踐方面意義重大。（2）由于沒有細胞壁，有利于進行體細胞誘導(dǎo)融合和單細胞培養(yǎng)。（3）可用于細胞表面的結(jié)構(gòu)與功能的研究，細胞器結(jié)構(gòu)與功能的研究，病毒侵染與復(fù)制機理的研究，細胞核與細胞質(zhì)相互關(guān)系，植物生長物質(zhì)的作用、植物代謝等生理問題的研究。4.2.1原生質(zhì)體分離材料的選擇：

葉肉細胞是分離原生質(zhì)體的最好的細胞材料，取生理狀態(tài)適宜的葉片，有利于原生質(zhì)體的細胞再生和細胞分裂。酶：分離原生質(zhì)體最常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。4.2.2原生質(zhì)體的培養(yǎng)4.2.2.1固體培養(yǎng)法

將懸浮在液體中的原生質(zhì)體懸液與熱融的含瓊脂的培養(yǎng)基等量混合，使瓊脂的最終濃度為

0.6％左右，冷卻后原生質(zhì)體包埋在瓊脂培養(yǎng)基中。

4.2.2.2液體培養(yǎng)

在培養(yǎng)基中不加凝膠劑，原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中。

4.2.2.3固液結(jié)合培養(yǎng)法

在培養(yǎng)皿的底部先鋪一薄層含凝膠劑的固體培養(yǎng)基，再在其上進行原生質(zhì)體的液體淺層培養(yǎng)。4.2.3細胞融合

4.2.3.1融合方式

主要是用各種化學(xué)試劑作為誘導(dǎo)劑，常用的方法有高鈣高pH法、聚乙二醇(PEG)法。

4.2.3.2融合過程

異種原生質(zhì)體先經(jīng)膜融合形成共同的質(zhì)膜，然后經(jīng)胞質(zhì)融合，產(chǎn)生細胞壁，最后是核融合。4.3花藥和花粉培養(yǎng)植物的花粉:是花粉母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的，其染色體數(shù)目只有體細胞的一半，叫做單倍體細胞?；ǚ酆突ㄋ幍呐囵B(yǎng):是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機能，不經(jīng)受精而發(fā)生細胞分裂，由單個花粉粒發(fā)育成完整植株的技術(shù)。單倍體植物：用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株。4.3.1花藥培養(yǎng)

4.3.1.1花藥材料的選擇

選擇大致處于所需要時期的花蕾。由于花粉發(fā)育時期和植株的某些外部形態(tài)特征之間的大致相關(guān)性，因此利用這些外部標志，選擇符合條件的花蕾，經(jīng)鏡檢確定花粉發(fā)育的準確時期。4.3.1.2培養(yǎng)基的選擇

花藥培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基是MS、N6、B5等。添加的激素有6-BA、KT和玉米素，2，4-D，NAA和IAA等。誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基可添加2，4-D，其濃度為1-3mg／L，分化培養(yǎng)基可添加2-3mg／L的BA，再加少許的IAA(0.2-0.5mg／L)，生根培養(yǎng)基可單獨添加生長素(0.5-lmg／L)。

4.3.1.3消毒接種培養(yǎng)表面消毒：常以70%酒精棉球擦拭材料外表或浸潤片刻即可。

接種：在超凈工作臺上用鑷子剝?nèi)ゲ糠只ü?，露出花藥，夾住花絲，取出花藥接種到培養(yǎng)基上。

培養(yǎng)：將培養(yǎng)材料置于25～28℃，光照強度2000～10000lx，光照時間12～18h/d。

4.3.1.4藥培養(yǎng)中的花粉發(fā)育過程

（1）營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑（2）生殖細胞發(fā)育途徑

（3）營養(yǎng)細胞和生殖細胞同時發(fā)育的途徑（4）花粉均等分裂途徑

4.3.2花粉培養(yǎng)

花粉培養(yǎng)是指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒作為外植體進行離體培養(yǎng)的技術(shù)。由于花粉已是單倍體細胞，誘發(fā)它經(jīng)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成的植株都是單倍體植株。且不受花藥的藥隔、藥壁、花絲等體細胞的干擾。但缺點是較比花粉培養(yǎng)難度大。

4.3.2.1花粉的分離將花藥放到加有基本培養(yǎng)基的小燒杯中，用注射器的內(nèi)管在燒杯的壁上擠壓花藥，使花粉從花藥中釋放出來。

4.3.2.2花粉的預(yù)處理

（1）低溫處理

（2）重力的作用

4.3.2.3培養(yǎng)基成分

選用Nitsch作基本培養(yǎng)基，含有諸如硝酸鈣、硫酸、檸檬酸鐵、酵母浸出液和椰子胚乳等。4.3.2.4花粉培養(yǎng)方法

（1）微室培養(yǎng)法（2）看護培養(yǎng)法4.3.3花粉植株的鑒定與染色體加倍

4.3.3.1花粉植株鑒定

（1）細胞學(xué)鑒定上（2）流式細胞分析法（3）氣孔大小及保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)目鑒定（4）植株形態(tài)指標鑒定上4.3.3.2花粉植株染色體加倍(1)自然加倍：通過花粉細胞核有絲分裂或核融合染色體可自然加倍，從而獲得一定數(shù)量的純合二倍體。(2)人工加倍：用秋水仙素處理單倍體植物，使染色體加倍的方法。處理方式有秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹田間單倍體植株的頂芽、腋芽等，處理時間和秋水仙素的濃度視材料而定。4.4胚胎培養(yǎng)

植物胚胎培養(yǎng)是胚及胚器官(如子房、胚珠)在離體無菌條件下，使胚發(fā)育成幼苗的技術(shù)。包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)等。4.4.1胚培養(yǎng)

4.4.1.1培養(yǎng)類型(1)成熟胚培養(yǎng)：培養(yǎng)較易成功，將其置于只含有大量元素和糖的較簡單培養(yǎng)基中，僅需提供一定的溫度、濕度就可以正常萌發(fā)長成植株。(2)幼胚培養(yǎng)：幼胚從生理至形態(tài)均未成熟，培養(yǎng)時完全依賴和吸收周圍組織的有機營養(yǎng)物質(zhì)，對培養(yǎng)基要求較高，僅提供一定的溫度和濕度均不能使其萌發(fā)，培養(yǎng)難度較大。4.4.1.2培養(yǎng)過程（1）培養(yǎng)基（2）生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（3）天然提取物的作用（4）溫光條件（5）其他條件4.4.2胚乳、胚珠和子房培養(yǎng)

4.4.2.1胚乳培養(yǎng)

將胚乳從母體上分離出來，放在無菌的人工環(huán)境條件下，讓其進一步生長發(fā)育，以至形成幼苗的過程。

4.4.2.1胚珠和子房培養(yǎng)

胚珠或授粉子房培養(yǎng)，合子胚可以更好地發(fā)育成植株。但如果條件不適，也容易從幼胚或珠心組織產(chǎn)生愈傷組織。4.5種質(zhì)資源的離體保存

種質(zhì)資源離體保存是指在離體條件下，將單細胞、原生質(zhì)體、愈傷組織、懸浮細胞、體細胞胚、試管苗等植物組織培養(yǎng)物，置于抑制其生長的無菌條件下，達到長期保存的方法。4.5.1種質(zhì)資源離體保存的意義

離體保存具有省時、省地、省力，不受環(huán)境因素的影響，便于植物資源的交換等優(yōu)點。離體保存的目的是保持培養(yǎng)物不死亡、不變異、不被污染，在需要時可重新恢復(fù)。4.5.2種質(zhì)資源離體保存的方法

4.5.2.1植物種質(zhì)資源的常溫限制生長保存

（1）常溫限制生長保存的概念

通過提高滲透壓、添加生長延緩劑或抑制劑、干燥、降低氣壓、改變光照條件等，限制培養(yǎng)物的生長，使轉(zhuǎn)移繼代的間隔時間延長達到保存種質(zhì)的方法。

（2）常溫保存的方法和原理

高滲保存法。生長抑制劑保存法。抑制生長的其他保存法。4.5.2.2植物種質(zhì)資源的低溫保存（1）低溫保存的概念低溫使植物生長速度就會受到抑制而減慢，老化程度延緩，因而延長了繼代的時間間隔而達到保存種質(zhì)的目的。（2）低溫保存的方法和原理控制保存材料所處的溫度和光照。0～6℃適宜保存溫帶起源植物的試管苗，15～20℃可用于熱帶植物試管苗的保存。（3）超低溫保存的基本程序包括培養(yǎng)物的選取、材料預(yù)培養(yǎng)、冷凍、貯存、解凍、再培養(yǎng)等。4.5.2.3植物種質(zhì)資源的超低溫保存（1）種質(zhì)資源超低溫保存的概念

超低溫