第13章 基因診斷(lsq)

第六節(jié)基因診斷GeneticDiagnosis第十三章

基因診斷基因診斷基因診斷基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變蛋白質(zhì)質(zhì)量的異?；虮磉_(dá)異常蛋白質(zhì)數(shù)量的異常外源基因的入侵

病毒感染等(一)診斷水平基因水平(二)診斷材料

DNA和RNA(三)診斷內(nèi)容1.對(duì)于內(nèi)源性基因來(lái)說(shuō)：基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)是否異常2.對(duì)于外源性基因來(lái)說(shuō)：病毒核酸、細(xì)菌質(zhì)粒、寄生蟲DNA

(四)診斷途徑1.直接檢查基因結(jié)構(gòu)是否存在：DNA點(diǎn)突變、缺失插入、基因重排、染色體畸變、mRNA剪接缺失錯(cuò)位或結(jié)構(gòu)變化等2.檢查基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA：①已經(jīng)轉(zhuǎn)錄還是沒有轉(zhuǎn)錄？②應(yīng)該轉(zhuǎn)錄還是不應(yīng)該轉(zhuǎn)錄？③

轉(zhuǎn)錄正常、過量還是過少？3.檢查基因表型：正常還是異常，進(jìn)行分析研究。(五)診斷目的1.確診相應(yīng)疾病或得出相應(yīng)結(jié)論。

2.是防治疾病或基因治療的根據(jù)?；蛟\斷概念的界定基因診斷概念的界定基因診斷一、基因診斷的概念和特點(diǎn)(一)定義一、基因診斷的概念和特點(diǎn)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法，直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷的方法。是以DNA和RNA為診斷材料,利用分子生物學(xué)技術(shù),通過檢查基因存在、缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程?；蛟\斷的原理：DNA診斷----檢測(cè)相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)功能是否正常。RNA診斷----對(duì)表達(dá)產(chǎn)物mRNA質(zhì)和量表達(dá)的分析。（二）特點(diǎn)（二）特點(diǎn)1．遺傳性疾病2．感染性疾病3．腫瘤4．法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用5．組織病理學(xué)針對(duì)性強(qiáng)特異性強(qiáng)靈敏度高適應(yīng)性強(qiáng)早期診斷(三)基因診斷方法和傳統(tǒng)疾病診斷方法的區(qū)別(三)基因診斷方法和傳統(tǒng)疾病診斷方法的區(qū)別表型診斷(傳統(tǒng)方法)基因診斷診斷依據(jù)疾病表型變化基因結(jié)構(gòu)異常和表達(dá)異常分類臨床診斷血清學(xué)診斷生化學(xué)診斷DNA診斷RNA診斷特異性表型改變?cè)诤芏嗲闆r下是非特異性的，往往難以明確診斷，延誤病情以探測(cè)基因?yàn)槟繕?biāo)，只要有特異性探針，利用分子雜交原理即可診斷，具有很高的特異性敏感性探針可用“放標(biāo)”或“非放診斷靈敏度高，標(biāo)本只需微量，DNApg水平即可早期診斷因?yàn)楸硇透淖兺霈F(xiàn)較晚，難以早期診斷在表型改變之前，基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)已發(fā)生改變，故往往可以早期診斷二、基因診斷常用技術(shù)和方法*核酸分子雜交技術(shù)

Southern印跡雜交

Northern印跡雜交

Western印跡雜交斑點(diǎn)雜交（狹縫雜交）原位雜交*PCR技術(shù)*單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)*限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)*DNA序列測(cè)定*DNA芯片技術(shù)

二、基因診斷常用技術(shù)和方法雜交信號(hào)檢測(cè)分子雜交樣本抽提DNARNAcDNA反轉(zhuǎn)錄合成寡核苷酸引物制備和標(biāo)記探針PCR擴(kuò)增分子診斷的基本技術(shù)流程分子診斷的基本技術(shù)流程（一）基因突變的診斷方法1.點(diǎn)突變的診斷:已知點(diǎn)突變：等位基因特異寡核苷酸探針

(PCR/ASO)未知點(diǎn)突變：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性分析

(PCR/SSCP)DNA測(cè)序(一)基因突變的診斷方法等位基因特異寡核苷酸探針(ASO)雜交法前題：遺傳性疾病基因的突變已知(位點(diǎn)和核苷酸序列)設(shè)計(jì)針對(duì)突變和正常的寡核苷酸探針分別進(jìn)行雜交擴(kuò)增DNA片段后，在嚴(yán)格條件下進(jìn)行斑點(diǎn)雜交和洗膜等位基因特異寡核苷酸探針(ASO)雜交法ASO探針法C正常T病人ASO探針GA探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子反向雜交(芯片技術(shù))反向雜交(芯片技術(shù))ATCG探針定位正常CT(純合子)CTCGCA(雜合子)（新突變）（新突變）等位基因特異寡核苷酸分子雜交(ASO)……GTGGGGCAAGGTGAA……

……CACCCCG

T

T

CCACTT…………GTGGGGCTAGGTGAA……

……CACCCCG

ATCCAC

T

T……

基因組DNACCCGTTCCACCCCGATCCAC探針ABC

地中海貧血CD17A→T點(diǎn)突變等位基因特異寡核苷酸分子雜交(ASO)鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥

Aprobe

SprobeHomoHeteroNormal-

珠蛋白基因點(diǎn)突變：GAG(Glu)→GUG(Val)

Aprobe：ACTCCTCTCGAGAAGTCTGCC

Sprobe：ACTCCTCACGAGAAGTCTGCCPCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)前提：突變未知、序列未知步驟：先確定有無(wú)突變、再確定突變位置是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法，常與PCR聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)。SSCP:相同長(zhǎng)度的單鏈DNA，因堿基序列不同，可形成不同的構(gòu)象，在聚丙烯酰胺凝膠電泳中產(chǎn)生不同的遷移率。這就是SSCP。PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，可分析確定突變是否存在，有了再測(cè)序。（檢測(cè)點(diǎn)突變）PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，可分析確定致病基因的存在。---------------------------primer---------------------------

↓

32P-dNTP摻入PCR擴(kuò)增

產(chǎn)物

↓

變性

↓

單鏈DNA

↓中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓

自顯影

↓

結(jié)果分析123451為正常；2、4、5為純合患者；3為雜合子Leber病患者是遺傳性視神經(jīng)病(線粒體DNA第11778位基因突變)5

3

3

5

G正常人PCR變性雜交電泳LeberPCR/SSCP病患者分析Leber病患者PCR/SSCP分析5

3

3

5

AG→A正常人純合突變雜合突變+大片段丟失或插入的診斷Southern印跡雜交多重PCR法少數(shù)核苷酸丟失或插入的診斷：點(diǎn)突變2.插入和丟失片段的診斷方法2.插入和丟失片段的診斷方法①跨越斷點(diǎn)的PCR基本思路：設(shè)計(jì)合成一對(duì)跨越突變斷裂點(diǎn)的引物，將待測(cè)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后電泳，從擴(kuò)增片段的大小直接判斷是否存在缺失突變。抽提基因組DNA(血液或組織)HindⅢ消化,瓊脂糖凝膠電泳凝膠放入堿性溶液,使DNA變性雜交洗膜放射自顯影和分析結(jié)果ABC缺失HindⅢHindⅢ設(shè)計(jì)探針標(biāo)記探針ABC大小Southern印跡雜交②多重PCR引物1和2：確定有無(wú)缺失及缺失片段的相對(duì)大小。引物3和4：確定缺失部位。利用DNA缺失區(qū)或片斷插入?yún)^(qū)的5

和3

引物進(jìn)行PCR，看擴(kuò)增片段長(zhǎng)度和數(shù)量的變異用于檢測(cè)特定基因序列的插入或缺失致病基因引物4引物1

引物2

引物3電泳杜式肌營(yíng)養(yǎng)不良癥杜式肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)屬X-連鎖遺傳病(XR)DMD基因是最大的基因，有79個(gè)外顯子DMD基因突變主要以缺失為主，可涉及基因的不同部位引物杜式肌營(yíng)養(yǎng)不良癥

多態(tài)性：在人群中，個(gè)體間基因組和核苷酸序列存在著差異，即DNA多態(tài)性。由于基因的突變發(fā)生在限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上,導(dǎo)致限制性片段數(shù)目和每個(gè)片段長(zhǎng)度的不同，稱為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性。3.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析3.限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析流程利用限制性內(nèi)切酶和特異性探針來(lái)檢測(cè)是否存在基因變異。酶切→電泳→雜交→看片段改變（多、少、長(zhǎng)或短，確定是否存在致病基因）結(jié)構(gòu)基因突變(點(diǎn)突變、缺失與插入)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)改變(原來(lái)位點(diǎn)消失或產(chǎn)生新的位點(diǎn)或識(shí)別位點(diǎn)位移)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析流程RFLP分析法分析法RFLPAAGC

T

TAAGCT

TT

T

CGAAT

TCGAA123切點(diǎn)切點(diǎn)HindⅢ酶切染色體DNA(a)AAGC

T

TAGACT

TT

T

CGAAT

CTGAA12

切點(diǎn)凝膠電泳分析酶切片段(b)長(zhǎng)片段DNA短片段DNA12

+132+1.15kb0.20kb×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5

3

正?；?

3

突變基因T→A1.35kbOxaN1鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析+0.2kbP1.15kbP1.35kbP正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析酶切電泳放射性探針雜交圖譜多態(tài)性

-地中海貧血HomoHeteroNormal5.2kb4.6kb

-珠蛋白基因3

末端缺失0.6kbβ-地中海貧血5

3

BgIIIBgIII5.2kb5

3

BgIIIBgIII4.6kb（二）基因表達(dá)異常的診斷基因表達(dá)異常量的異常質(zhì)的異常量增多、不該表達(dá)而表達(dá)量減少、該表達(dá)不表達(dá)1.mRNA相對(duì)定量

(1)點(diǎn)雜交(或狹縫雜交)光密度掃描法；

(2)

RT-PCR；2.