第二章 一般組織化學(xué)技術(shù)

標(biāo)本制備技術(shù):組織化學(xué)的基本要求：保持組織細(xì)胞良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)。具備高度的特異性。應(yīng)有一定的靈敏性。4.可重復(fù)性。5.生物反映的產(chǎn)物必須在原位沉淀、色深、不溶和具有穩(wěn)定性的特點。組織切片技術(shù):

（一）冰凍切片：速凍：干冰—丙酮（酒精）法：

液氮法：2.蔗糖浸泡法：（二）石蠟切片：是經(jīng)典而最常用的技術(shù)。步驟：共5大步驟：

①取材→→②固定→→③脫水→→

④浸蠟、包埋→→⑤切片

玻片處理和涂膠：

（三）振動切片：（四）塑料切片：（五）超薄切片：用于電鏡組織化學(xué)。（六）碳蠟切片：組織化學(xué)的基本程序一、選題：

確定研究對象（內(nèi)容）。依據(jù)前期研究和文獻(xiàn)資料。二、選方法：原則：

應(yīng)盡量簡單，特異性和靈敏度高，易得結(jié)果，結(jié)果可靠性強。三、準(zhǔn)備階段：1.試劑、藥品:2.動物:3.實驗（模型）:4.標(biāo)本制備（備用）:四、組織化學(xué)反應(yīng)：五、觀察、記錄及結(jié)果統(tǒng)計分析：六、查文獻(xiàn)寫論文：

一般組織化學(xué)技術(shù)一、酶組織化學(xué)（一）基本概念及分類特點：①酶蛋白是大分子，而一般催化劑為小分子。②酶具有高效的催化能力，其催化效能比一般催化劑高很多倍。③酶催化反應(yīng)條件溫和，近中性和常溫下即可發(fā)生酶催化反應(yīng)。④酶對催化的底物具有高度的專一性。⑤酶分子結(jié)構(gòu)多種多樣，其活性受體內(nèi)多種因素的調(diào)控

分為六類：

a.氧化還原酶類：b.轉(zhuǎn)移酶類：

c.水解酶類：

d.裂合酶類：e.異構(gòu)酶類：f.合成酶類:（二）酶的保存及影響酶催化反應(yīng)的因素1.酶濃度的影響：2.底物濃度的影響：3.激活劑濃度的影響：抑制劑的影響：

根據(jù)抑制劑對酶的抑制作用不同：不可逆性抑制：可逆性抑制：競爭性抑制：非競爭性抑制：反競爭性抑制：5.PH值對反應(yīng)的影響：最適PH值常表現(xiàn)于三個方面：

一是對Vmacr反應(yīng)速度的影響。二是對Km或?qū)Φ孜锱c酶的親和性的影響。三是對酶穩(wěn)定性的影響。

確定最適PH的方法：

一是查閱文獻(xiàn)，根據(jù)前人的經(jīng)驗，預(yù)實驗印證（堿性磷酸酶9.2，酸性磷酸酶5.0）。

二是實驗測定最適PH值。6.溫度的影響:一是溫度能影響酶分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及其與底物分子之間的親和性。

二是溫度能影響酶底物復(fù)合物分解速度。三是溫度能影響激動劑或抑制親和性。（三）顯示酶的組化方法及原理在酶的顯示方法中，從原理講，可分兩大類：一類是顯示酶的活性—酶組織化學(xué)方法：屬于一般組化方法。二類是顯示酶的本質(zhì)，即酶蛋白的存在及存在部位—免疫酶組織化學(xué)。

在酶組織化學(xué)中，根據(jù)其反應(yīng)原則，顯示酶的方法，可分為兩類：1.沉淀反應(yīng)法：

主要用于顯示分解酶類。

又分兩類：

①金屬陽離子沉淀法：S→生成物中有基團+金屬離子結(jié)合→沉淀（有色）。

②偶聯(lián)偶氮沉淀反應(yīng)法：S→生成物中有基團+重氮鹽→不溶的有色沉淀（偶氮染料）。

2.電子傳遞法：主要顯示氧化酶和脫氫酶。（四）組化中常用的酶類

1.標(biāo)準(zhǔn)和要求:（1）酶的純度較高，容易獲得且價格低廉。（2）當(dāng)酶與抗體或抗生物素蛋白結(jié)合后，酶的活性不變。（3）結(jié)合后的酶分子在液相中能保持穩(wěn)定。（4）內(nèi)源性酶的活性應(yīng)受到最大限度的降低，使之不能干擾與特異性抗原相關(guān)的染色過程。（5）酶反應(yīng)的產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，容易被檢測。

2.常用酶：（1）辣根過氧化物酶（HRP）：常用HRP標(biāo)記抗體。顯色原有：

①DAB：

H2O2→H2O+O→+DAB→原位棕黃色沉淀。②AEC：氧化后玫瑰紅色沉淀，易溶于醇。③CN：氧化后藍(lán)色沉淀，易溶于醇及有機溶劑，且易擴散。④H-Y試劑：氧化后藍(lán)黑色沉淀。（2）小牛腸堿性磷酸酶（CIAP）：顯色原有：①固紅TR：產(chǎn)物呈鮮紅色。固藍(lán)BB：產(chǎn)物呈亮藍(lán)色。均易溶于醇和有機溶劑，故及時處理切片。

②新堿性品紅（NF）：產(chǎn)物呈紅色,不易溶于醇和有機溶劑，其顯色強度高于固紅TR和固藍(lán)BB。（3）葡萄糖氧化酶（尼腺曲霉菌素源）常用的顯色原有：①2-P-碘酚-3-P-硝基苯-5-酚氯化四氮唑（INT）：產(chǎn)物呈紅色，易溶于有機溶劑。②氮藍(lán)四唑（NBT）：產(chǎn)物呈藍(lán)黑色?，F(xiàn)用于雙重染色。③四硝基氮藍(lán)四唑（TNBT）：產(chǎn)產(chǎn)物呈灰褐色，不溶于有機溶劑。（4）β-半乳糖苷酶（大腸桿菌來源）5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷，產(chǎn)物呈靛藍(lán)色沉淀。

最常用的酶為HRP。

（五）常見酶組織化學(xué)技術(shù)（自學(xué)）二、糖組織化學(xué)技術(shù)（一）概述：一般分四類：1.多糖：2.粘液物質(zhì)：3.糖蛋白：4.粘液脂類：（二）顯示方法：

PAS反應(yīng)：過碘酸雪夫（Schiff）氏法。反應(yīng)產(chǎn)物呈紫色沉淀。在反應(yīng)中，特別注意PH和溫度。此外HI04還能氧化其它基團：α-氨基醛、酮類、絲氨酸、α-氨基醇等。三、核酸組織化學(xué)技術(shù)（一）概述：

（二）顯示方法：1.福爾根（Feulgen）顯示DNA法：2.其它方法自學(xué)。

四、蛋白質(zhì)組織化學(xué)五、熒光組織化學(xué)（一）概述：（二）分類：

1.自發(fā)熒光：2.誘發(fā)熒光：（1）甲