三七傷藥膠囊中三七總皂苷含量測(cè)定方法的建立

三七傷藥膠囊中三七總皂苷含量測(cè)定方法的建立

三七是三七科的一種植物。它可以緩解血液抑制、腫脹和疼痛。三七總皂苷含有人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1和三七皂苷R1、R2、R3、R4、R6等20余種皂苷成分,均屬達(dá)瑪烷型(Dammaranetype)四環(huán)三萜皂苷。其中人參皂苷Rb1(Rb1)、人參皂苷Rg1(Rg1)是三七總皂苷中含量最高的兩個(gè)成分,而三七皂苷R1(R1)則是三七總皂苷的特征化合物。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),三七總皂苷的藥理活性主要在于改善血液系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)功能、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、調(diào)節(jié)免疫等方面,用于急慢性挫傷、扭傷、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛、跌打損傷等。三七常用于復(fù)方中,對(duì)三七及其制劑的化學(xué)成分分析,成為了評(píng)價(jià)其藥品質(zhì)量的重要方法。建立三七制劑中三七總皂苷含測(cè)方法,為三七總皂苷的定量提供技術(shù)依據(jù)與參考。三七傷藥膠囊處方是由三七、草烏(蒸)、雪上一枝蒿、冰片、骨碎補(bǔ)、紅花、接骨木、赤芍組成,其功能主要是舒筋活血,散瘀止痛。三七傷藥膠囊法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中控制三七含量主要是以人參皂苷Rbl及人參皂苷Rg1為指標(biāo)成分,其方法操作極為繁瑣、復(fù)雜。故本實(shí)驗(yàn)旨在探索研究建立更為簡捷的含量測(cè)定方法。1藥品對(duì)照品島津UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì);三七傷藥膠囊(市售;批號(hào):20080412,20080616,20081024);對(duì)照品:人參皂苷Rg1(中國藥品生物制品檢定所提供,批號(hào)為:110703-200726);試劑:甲醇、正丁醇、NaOH、香草醛、冰醋酸均為分析純。2方法和結(jié)果2.1對(duì)照溶液的制備精密稱取對(duì)照品人參皂苷Rg1適量,置25mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,配制成濃度為0.1026mg/ml的對(duì)照品溶液。2.2全波長掃描結(jié)果取人參皂苷Rg1對(duì)照品溶液(0.1026mg/ml)、樣品溶液經(jīng)香草醛-高氯酸顯色后,進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果見圖1。由全波長掃描結(jié)果可知:樣品最大吸收波長(550.0nm)與人參皂苷Rg1最大吸收波長(550.0nm)相同。故檢測(cè)波長選擇550.0nm。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱定適量人參皂苷Rg1加甲醇配制成濃度為0.1010mg/ml的溶液,精密吸取該對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml至10ml容量中,用甲醇稀釋至刻度,依上法檢測(cè),以吸光度為縱坐標(biāo),人參皂苷Rg1的濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:y=3.57×10-2x+1.66×10-2(r=0.9994)。結(jié)果表明,人參皂苷Rg1濃度在5.05～30.30μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。2.4供試品溶液的制備提取溶劑選擇水飽和正丁醇。精密稱取三七傷藥膠囊內(nèi)容物0.1203g,研細(xì),置250ml具塞錐形瓶中,加50ml水飽和正丁醇密塞,超聲處理(功率250W,頻率50Hz)30分鐘,再轉(zhuǎn)置圓底燒瓶中,加入水飽和正丁醇50mL,電熱套加熱回流30分鐘,趁熱過濾至分液漏斗中,用1%NaOH溶液洗滌2次,每次15ml,取正丁醇層揮干溶劑,甲醇轉(zhuǎn)溶到25ml容量瓶,精密量取1ml到具塞試管,水浴揮干溶劑,精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL顯色,在(60±1)℃水浴中保溫15min,立即置冰水浴中冷卻,加入冰醋酸5.0mL搖勻,放置15min,作為供試品溶液。用相應(yīng)試劑平行進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn),用紫外-可見分光光度儀測(cè)定吸光度,計(jì)算總皂苷含量。2.5供試陰性樣品測(cè)定按處方中藥味比例,配制不含三七的君藥,按供試品制備工藝制備成供試陰性樣品,再按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照樣品,依法測(cè)定,結(jié)果陰性對(duì)照溶液在550.0nm處吸收為0.011,干擾為樣品吸光度的2.0%,可忽略不計(jì)。2.6測(cè)定樣品時(shí)間取樣品供試溶液,按上述方法處理后,做連續(xù)時(shí)間下紫外掃描,并于1、2、3、4小時(shí)各測(cè)一次吸光度,結(jié)果表明,供試品溶液不穩(wěn)定,所以需定時(shí)測(cè)定樣品,時(shí)間確定為30min內(nèi)。2.7精密度測(cè)試取一份供試溶液,按上述測(cè)定方法在550nm波長處重復(fù)測(cè)6次,結(jié)果吸光度的RSD值為0.7%,表明紫外可見分光光度儀精密度良好。2.8重復(fù)性試驗(yàn)按2.4項(xiàng)下方法,取同一樣品6份,分別制備成供試品溶液,測(cè)定吸光度值,計(jì)算總皂苷含量,結(jié)果總皂苷的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.5%,表明該方法重復(fù)性良好。2.9加樣回收率測(cè)定精密稱取已知含量的供試品粉末(含量0.0189g/g)約0.075g,平行6份,分別精密加入人參皂苷Rg1對(duì)照品0.00138g,依上述方法測(cè)定,按下式計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。結(jié)果表明回收率良好。2.10加樣樣品的測(cè)定精密稱取1項(xiàng)下三批試藥樣品適量,按2.4項(xiàng)下方法制備成供試液,分別測(cè)定其含量,結(jié)果三個(gè)批號(hào)的供試樣品中三七總皂苷含量分別為0.0193、0.0189、0.0185g/g,RSD=2.1%,說明供試樣品中三七總皂苷含量穩(wěn)定,生產(chǎn)工藝成熟、穩(wěn)定、可靠。3討論3.1堿洗次數(shù)的確定由于三七傷藥膠囊中含有的黃酮類化合物對(duì)三七總皂苷的含量測(cè)定干擾比較大,選擇堿洗的方法去除干擾,并進(jìn)行了堿洗次數(shù)和用量的考察。理論上堿洗次數(shù)越多,用量越大,則去除的黃酮類化合物越多,最后干擾越小,但堿洗去除黃酮類化合物的同時(shí),三七總皂苷也會(huì)流失,使回收率下降;堿洗次數(shù)越少,用量越少,則三七總皂苷的損失越少,但殘留的黃酮類化合物越多,陰性干擾越大。要在陰性干擾與回收率之間取得平衡,實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)堿洗次數(shù)為兩次(每次15ml)時(shí),陰性干擾比較小而回收率也在95%以上,所以選擇堿洗兩次(每次15ml)。3.2加樣回收率及加樣回收率本實(shí)驗(yàn)方法陰性干擾為3.1%,人參皂苷Rg1在上述濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,加樣平均回收率為95.9%,RSD為2.3%。證實(shí)本方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好,可作為該制劑中