皮膚影像的研究進(jìn)展

皮膚影像的研究進(jìn)展

1皮膚影像學(xué)的發(fā)展皮膚組織病理學(xué)是皮膚科學(xué)不可或缺的組成部分。它不僅是許多皮膚科疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，也是皮膚科疾病發(fā)生和發(fā)展規(guī)律的基礎(chǔ)，是皮膚科疾病的治療。皮膚組織病理學(xué)經(jīng)過(guò)200余年的發(fā)展,已經(jīng)普及并延伸出免疫病理等多個(gè)分支。然而,組織病理學(xué)活檢取材一般為創(chuàng)傷性的,患者疼痛、易感染、留疤痕,病理切片的制作費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且僅能提供活檢部位的信息,監(jiān)測(cè)疾病變化、評(píng)價(jià)療效、確定皮損的邊界等常需要反復(fù)活檢,這一切都降低了患者的依從性。皮膚科臨床的發(fā)展需要無(wú)創(chuàng)性、原位、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的檢測(cè)方法,對(duì)可疑皮損進(jìn)行重復(fù)檢查,提供客觀量化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。臨床的需求促進(jìn)了皮膚影像學(xué)的產(chǎn)生和發(fā)展。皮膚影像學(xué)是利用現(xiàn)代超聲、光學(xué)、磁共振等手段對(duì)皮膚病進(jìn)行無(wú)創(chuàng)、原位、動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)診斷的一門(mén)新型技術(shù)學(xué)科。過(guò)去十幾年作為醫(yī)學(xué)影像學(xué)分支的皮膚影像學(xué)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,包括皮膚鏡、皮膚共聚焦技術(shù)、多光子成像、光學(xué)相干層析成像和光聲成像等多種光學(xué)成像技術(shù)用于臨床疾病診斷已成為可能。本文將對(duì)皮膚影像學(xué)的幾種主要成像技術(shù),結(jié)合原理及具體臨床應(yīng)用做簡(jiǎn)要的介紹。2皮膚鏡2.1皮膚鏡的應(yīng)用皮膚鏡,又稱為表皮透光顯微鏡、皮表顯微鏡、入射光顯微鏡等,是一種在體觀察皮膚表面以下微細(xì)結(jié)構(gòu)的、主要針對(duì)色素性皮膚疾病的無(wú)創(chuàng)性輔助診斷儀器。它通過(guò)使用油浸、光照與光學(xué)放大設(shè)備,可以觀察到包括表皮下部、表真皮連接以及乳頭層真皮等肉眼不可見(jiàn)的皮膚結(jié)構(gòu),從而確定需要做活組織檢查的皮損部位,保證切除的準(zhǔn)確性,其對(duì)于惡性黑色素瘤早期診斷的重要輔助價(jià)值已為大量研究所證實(shí)[1~6]。作為臨床上諸多疾病的篩選和診斷工具,皮膚鏡具有無(wú)損傷、診斷迅速、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn),有著良好的發(fā)展前景。利用顯微鏡來(lái)觀察皮膚表面可以追溯到1663年,JohanKolhaus在顯微鏡下觀察到指甲甲襞下的微小血管。19世紀(jì)末,德國(guó)皮膚病學(xué)家Unna把油浸法應(yīng)用于皮膚的顯微檢查,以減少皮膚表面的直接反射光,使觀察更加清楚。20世紀(jì)初,Saphier將雙筒顯微鏡和內(nèi)置光源相結(jié)合,對(duì)皮膚解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察。20世紀(jì)50年代,美國(guó)的Goldman首次提出dermoscopy一詞,并將其應(yīng)用于色素皮損的診斷。1971年,英國(guó)的RonaMackie研究表明,皮膚鏡在提高色素皮損的術(shù)前診斷以及鑒別良性色素痣和惡性黑色素瘤上有很大意義。其后,關(guān)于皮膚鏡的研究在奧地利、德國(guó)、美國(guó)以及世界各地得到延續(xù)。第一屆皮膚鏡的共識(shí)會(huì)議于1989年在德國(guó)漢堡召開(kāi),2001年,第一屆世界皮膚鏡大會(huì)在羅馬舉行?，F(xiàn)在,皮膚鏡在歐洲已成為一項(xiàng)常規(guī)技術(shù),并在世界其他地區(qū)獲得越來(lái)越多的認(rèn)可。2.2雙側(cè)左面質(zhì)的皮膚鏡由于皮膚的光密度和折射率與空氣不同,照射到皮膚表面的光線很大部分被角質(zhì)層直接反射,另有部分為皮膚吸收,僅有少量通過(guò)散射進(jìn)入皮膚,因此很難用肉眼直接看到皮膚表面下的結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)皮膚鏡采用的是浸潤(rùn)法:首先在皮膚表面滴加油脂等浸潤(rùn)液以增加皮膚角質(zhì)層的透光性和減少反射光,然后用玻片壓平并給予適當(dāng)角度的光線照射,借助于特定的光學(xué)放大設(shè)備,可以觀察到表真皮連接處、真皮的結(jié)構(gòu)。使用的浸潤(rùn)液可以是水、礦物油、乙醇和凝膠等。最新的研究表明,體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇具有較少的氣泡,可產(chǎn)生清晰圖像,并且具有不油膩、不染色、自然揮發(fā)無(wú)需擦拭、可有效減少細(xì)菌污染的特點(diǎn)。水溶性的凝膠(例如超聲用耦合劑)不會(huì)流動(dòng)或者產(chǎn)生灼燒,因而在眼睛或者粘膜區(qū)域(例如嘴唇)應(yīng)用較多。簡(jiǎn)單的手持式皮膚鏡(圖1)由鹵素?zé)艋虬l(fā)光二極管(LED)光源、標(biāo)準(zhǔn)放大物鏡(通常為10倍)以及玻片組成,價(jià)格低廉且便于使用。有些可通過(guò)特定的轉(zhuǎn)接環(huán)與數(shù)碼相機(jī)連接,便于將成像結(jié)果及時(shí)拍照存檔,為以后的診斷和治療服務(wù)。昂貴的雙目皮膚鏡包括6~40倍的放大范圍,可以提供高質(zhì)量的成像,并對(duì)皮膚進(jìn)行三維觀察。電子皮膚鏡中整合有視頻攝像頭,通過(guò)數(shù)據(jù)線將視頻數(shù)據(jù)傳輸?shù)诫娔X中,在顯示器上觀察的同時(shí),可對(duì)圖像進(jìn)行處理,利于疾病的準(zhǔn)確診斷,也可將數(shù)據(jù)存入數(shù)據(jù)庫(kù),便于歸檔調(diào)用。傳統(tǒng)的浸潤(rùn)型皮膚鏡由于需要采用耦合劑即浸潤(rùn)液,可能會(huì)引發(fā)接觸性皮炎和醫(yī)源性交叉感染。近年來(lái),一種新出現(xiàn)的偏振光皮膚鏡克服了浸潤(rùn)型皮膚鏡的缺點(diǎn)。偏振光皮膚鏡是21世紀(jì)開(kāi)始發(fā)展起來(lái)的皮膚鏡技術(shù),主要利用交叉偏振的原理,不需涂抹浸潤(rùn)液,就可消除皮膚表面反射光的影響。入射光通過(guò)一個(gè)線偏振片照射到皮膚表面,直接反射的光保持原來(lái)的偏振方向,而被皮下組織散射的光改變了偏振方向。使用與第一個(gè)偏振片偏振方向垂直的線偏振片即可把直接反射光濾去(圖2),從而可以觀察到皮膚下的組織結(jié)構(gòu),這樣就提高了皮損的可視性。觀察時(shí)鏡片不直接接觸皮膚和無(wú)需耦合劑,減少了人為對(duì)皮膚的擠壓,即可觀察到清晰的原始圖像,特別適合頭面部,尤其在口、眼和鼻等粘膜處以及敏感性皮膚的圖像觀察,可避免由浸潤(rùn)法觀察時(shí)鏡片直接接觸皮膚的擠壓變形和所需的浸潤(rùn)液作耦合劑而引起交叉感染等潛在危險(xiǎn)。2.3皮膚鏡的診斷較之傳統(tǒng)的毛細(xì)血管鏡,皮膚鏡可以直接觀察皮損部位的深在微細(xì)結(jié)構(gòu),為皮膚形態(tài)學(xué)開(kāi)辟了一個(gè)新的研究領(lǐng)域。在減少不必要的活檢、方便疾病隨訪與大規(guī)模普查、圖像資料的保存與提取方面有著明顯的優(yōu)點(diǎn)。皮膚鏡在臨床上可以用于多種皮膚病的在體檢查,其中基本的皮膚鏡圖像包括色素網(wǎng)、小點(diǎn)、小球、分支條紋、偽足、放射流、條紋、無(wú)結(jié)構(gòu)區(qū)、大斑點(diǎn)、退化結(jié)構(gòu)、藍(lán)白幕和血管結(jié)構(gòu)等(圖3)。醫(yī)生可以借助皮膚鏡觀察到不同皮膚病的不同表現(xiàn)從而為臨床診治提供可靠的依據(jù)。皮膚鏡已經(jīng)成功地應(yīng)用于惡性黑素瘤的臨床診斷。對(duì)于以惡性黑素瘤為核心的色素病的皮膚鏡鑒別診斷,目前多推薦用兩步法。第一步先區(qū)分黑素性皮損與非黑素性色素性皮損:診斷為黑素性皮損,至少應(yīng)具備色素網(wǎng)、色素紋、群集性小球、均質(zhì)藍(lán)色色沉等指征之一;如沒(méi)有,則診斷為非黑素性色素病,并進(jìn)一步尋找非黑素性皮損的特點(diǎn)。第二步為區(qū)分良性與惡性的黑素性損害:有多種方法,最經(jīng)典的是1987年由Pehamberger等建立的模式分析法。此法要求對(duì)多個(gè)皮膚鏡指征逐一進(jìn)行詳細(xì)評(píng)估、比對(duì),然后得出最終診斷。此法雖然具有較高的敏感性、特異性和診斷準(zhǔn)確率,但要求診斷者接受過(guò)相關(guān)的正規(guī)培訓(xùn),否則會(huì)影響診斷準(zhǔn)確率。為提高可操作性和可重復(fù)性,許多研究小組根據(jù)各自經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立了不同的診斷方法及標(biāo)準(zhǔn)。常用的有Stolz等的皮膚鏡ABCD法則,Menzies等的診斷侵襲性惡性黑素瘤的11點(diǎn)特征法,Aegenziano等的7點(diǎn)核對(duì)表,DalPozzo等的7點(diǎn)特征法等。近年來(lái)的研究分析也證實(shí),對(duì)于有經(jīng)驗(yàn)的檢測(cè)者,皮膚鏡可顯著地提高惡性黑素瘤的診斷準(zhǔn)確率。此外,應(yīng)用皮膚鏡技術(shù)還可明顯提高Spitz痣、基底細(xì)胞癌、血管瘤的診斷準(zhǔn)確率,并可以用于脂溢性角化病、銀屑病、日光性黑子、色素性光線性角化和皮膚纖維癌等多種皮膚疾病。3皮膚超聲檢查的特點(diǎn)皮膚科臨床的發(fā)展需要無(wú)創(chuàng)性、原位、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的檢測(cè)方法,對(duì)可疑皮損進(jìn)行重復(fù)檢查,提供客觀量化的評(píng)價(jià)指標(biāo)。然而,皮膚鏡只能對(duì)皮損表面進(jìn)行檢查,對(duì)于深層皮膚結(jié)構(gòu)無(wú)能為力;皮膚超聲雖然能對(duì)深層皮膚結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè),但其圖像分辨率較低,不能達(dá)到細(xì)胞水平,無(wú)法根據(jù)其聲像圖來(lái)判斷皮膚腫瘤的良惡性和確定皮損的浸潤(rùn)范圍,其檢查結(jié)果也易受患者體位、探頭壓力等多種因素影響。基于共聚焦原理的皮膚原位、在體、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)三維成像技術(shù)[皮膚計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(CT)]克服了以上幾種方法的局限性,是具有廣闊發(fā)展前景的無(wú)創(chuàng)性皮膚影像學(xué)方法。3.1從clsm發(fā)展到產(chǎn)物1957年,Marvin在他的專利中闡明了共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)技術(shù)的基本原理;1985年,Wijnaendts等成功地用共聚焦激光顯微鏡演示了用熒光探針標(biāo)記的生物材料的光學(xué)橫斷面,標(biāo)志著共聚焦激光顯微鏡的關(guān)鍵技術(shù)已基本成熟。而第一臺(tái)商業(yè)化的共焦掃描顯微鏡則是到1987年才問(wèn)世。之后的十幾年間CLSM發(fā)展非常迅速。CLSM是一種先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器,是一項(xiàng)具有劃時(shí)代意義的高科技新產(chǎn)品,是近代生物醫(yī)學(xué)圖像分析儀器最重要的發(fā)展之一,有細(xì)胞“CT”之稱。它是隨著激光、視頻、計(jì)算機(jī)等技術(shù)的飛速發(fā)展而誕生的新一代顯微鏡,在研究和分析活細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子、離子的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,組織和細(xì)胞的光學(xué)連續(xù)切片和三維結(jié)構(gòu)重建等方面,是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡所望塵莫及的。20世紀(jì)90年代中期,學(xué)者們將CLSM進(jìn)行改造,使其能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)活體皮膚的無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)成像,由此奠定了皮膚CT在皮膚科推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)。3.2皮膚ct成像技術(shù)原理傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)主要由機(jī)械部分、照明部分和光學(xué)部分(反光鏡、聚光鏡、光圈、目鏡和物鏡等)組成。皮膚CT的基本結(jié)構(gòu)除了光學(xué)顯微鏡部分之外,主要由激光光源、掃描裝置、檢測(cè)器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(包括數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換及應(yīng)用軟件)、圖像輸出設(shè)備和共聚焦系統(tǒng)(圖4)等部分組成。由此可見(jiàn),皮膚CT具有傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡所不具備的復(fù)雜計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、激光系統(tǒng)、掃描裝置和共聚焦系統(tǒng);另外一個(gè)最主要的區(qū)別在于光源的不同。光學(xué)顯微鏡的光源一般是自然光或者是內(nèi)置燈源,可見(jiàn)光經(jīng)反光鏡、聚光鏡的作用,對(duì)全視野進(jìn)行照明,它只能對(duì)標(biāo)本局部厚度作平面成像。這樣不僅要求標(biāo)本為薄切片(5~10μm),而且標(biāo)本上任何一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)衍射光和散色光的影響,降低了圖像的反差和分辨率。而皮膚CT采用點(diǎn)光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)光鏡的場(chǎng)光源,光源、探測(cè)器及被測(cè)樣品置于共軛位置。聚焦層面的光點(diǎn)通過(guò)一系列透鏡最終可同時(shí)聚焦于光源針孔和檢測(cè)針孔,也就是所謂的“共聚焦”。從光源出射的光經(jīng)物鏡準(zhǔn)確地照明物鏡焦平面的被測(cè)樣品,由樣品反射的光信息被聚焦到針孔處,形成點(diǎn)像,從而通過(guò)針孔被探測(cè)器接收。而非焦平面反射的光信息,則在探測(cè)面上僅僅形成彌散斑,此時(shí)通過(guò)針孔被探測(cè)器接收到的光信息很少。也就是說(shuō),探測(cè)到的離焦信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)低于焦點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度,對(duì)離焦信號(hào)的擯棄使共焦成像術(shù)可在三維空間上精確定位被測(cè)樣品。以激光作光源并對(duì)樣品進(jìn)行掃描,在此過(guò)程中兩次聚焦,因此稱為共聚焦激光掃描顯微鏡。其產(chǎn)生的光信號(hào)由檢測(cè)針孔后的光電倍增管逐點(diǎn)接收后,轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)傳輸至計(jì)算機(jī),在屏幕上呈現(xiàn)為清晰的整幅焦平面圖像。點(diǎn)光源可通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行左右、上下掃描來(lái)獲得厚標(biāo)本(可達(dá)500μm)不同層面的圖像,亦即可對(duì)細(xì)胞或組織厚片進(jìn)行類似CT斷層掃描的無(wú)損傷性連續(xù)光學(xué)切片,連續(xù)光學(xué)切片經(jīng)計(jì)算機(jī)三維重建處理,能夠從任意角度觀察標(biāo)本的三維剖面或整體結(jié)構(gòu)。因此該技術(shù)被稱為皮膚CT。皮膚CT圖像基于細(xì)胞器和組織機(jī)構(gòu)自身的折射率不同而得以實(shí)現(xiàn)高分辨率;皮膚組織中黑色素和角蛋白具有較高的折射率,是自然對(duì)照物。高折射率結(jié)構(gòu)對(duì)比明亮,低折射率結(jié)構(gòu)則顯灰暗。3.3皮膚ct的應(yīng)用皮膚CT能夠在細(xì)胞水平上實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)觀察皮膚組織的形態(tài)結(jié)構(gòu),皮膚CT在皮膚科主要應(yīng)用于:1)檢測(cè)/監(jiān)測(cè)藥物經(jīng)皮輸送過(guò)程;2)檢測(cè)細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)和皮膚組織細(xì)胞因子變化;3)檢測(cè)/監(jiān)測(cè)傷口愈合的過(guò)程;4)皮膚科疾病的診斷、鑒別診斷、療效評(píng)價(jià)和隨訪。皮膚CT在毛囊炎、銀屑病和血管性皮膚病等皮膚病的診斷中極具應(yīng)用價(jià)值。皮膚CT應(yīng)用于皮膚腫瘤或癌前性皮損的診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)和確定腫瘤皮損與周?chē)Ｆつw邊界。自1995年首次報(bào)道皮膚CT在體觀察皮膚以來(lái),目前皮膚CT已經(jīng)用于多種皮膚疾病的臨床評(píng)估,并顯示良好的臨床應(yīng)用前景。腫瘤的診斷和癌前病灶的評(píng)價(jià)仍是大家最感興趣的研究領(lǐng)域。Gerger等從20例黑素瘤和50例色素痣的3709幅混合成像中篩選出兩種疾病的皮膚CT形態(tài)學(xué)特征(圖5),隨后用三步法模式來(lái)診斷色素痣和黑素瘤,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者診斷正確率分別為92.4%和97.6%,顯著優(yōu)于目前廣泛應(yīng)用于臨床的皮膚鏡。Gerger等先前也進(jìn)行過(guò)類似的臨床實(shí)驗(yàn),評(píng)估報(bào)告顯示,皮膚CT對(duì)黑素瘤、色素痣、基底細(xì)胞癌以及脂溢性角化的診斷準(zhǔn)確率分別為96.30%,98.89%,100%和100%,顯示很好的臨床可靠性。目前美國(guó)Lucid公司生產(chǎn)的Vivascope1500系統(tǒng)(圖6),其采用的光源為830nm近紅外光,橫向分辨率為1~2μm,縱向分辨率為3~4μm,穿透深度可達(dá)200~500μm,能在細(xì)胞水平在體觀察表皮和真皮淺層,滿足大多數(shù)皮膚疾病的影像學(xué)診斷。4用于皮膚科診斷的多光學(xué)圖像4.1多光子層析成像幾十年來(lái),皮膚診斷學(xué)一直建立在二維層次上,通常在白光或者使用伍德氏燈照明的條件下用裸眼或通過(guò)放大鏡觀察。伍德氏燈是一種紫外/藍(lán)光光源,可以提供表面熒光的信息。為了獲得數(shù)字化的皮膚影像,電荷耦合器件(CCD)鏡頭和圖像處理軟件開(kāi)始投入應(yīng)用。具有代表性的是作為光源而投入使用的偏振發(fā)光二極管,然后用CCD鏡頭獲取散射光。當(dāng)使用紅光或者紅外光時(shí),相對(duì)于藍(lán)光和紫外光,漫反射信號(hào)可以得到皮膚的深度信息。表皮和真皮的三維成像可以用超聲波或者光學(xué)相干層析(OCT)系統(tǒng)獲得。然而,這些技術(shù)卻不能對(duì)單一的內(nèi)組織細(xì)胞或者胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成像觀察。要想對(duì)細(xì)胞和亞細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,并且能夠提供合適的分辨率,就需要采用共焦掃描熒光,但是這類系統(tǒng)存在著一個(gè)主要的缺陷,就是它需要引入外界的異硫氰酸熒光素(FITC)熒光標(biāo)記。與上述情況形成對(duì)比的是,多光子層析成像作為一種能夠達(dá)到亞細(xì)胞級(jí)別精度的新式多層面成像技術(shù),能夠敏感地檢測(cè)內(nèi)在熒光基團(tuán)發(fā)光以及膠原細(xì)胞外基質(zhì)的二次諧波(SHG)信號(hào),并且不需要對(duì)皮膚進(jìn)行染色。從原理上來(lái)說(shuō),單分子檢測(cè)可由單光子計(jì)數(shù)(SPC)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。這是因?yàn)樗幕A(chǔ)并不是建立在共焦檢測(cè)上,所以不需要針孔,信號(hào)并不需要向后傳輸通過(guò)掃描系統(tǒng)。多光子層析成像能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)深層組織細(xì)胞和細(xì)胞室的成像。尤其值得一提的是,熒光線粒體中輔酶還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD(P)H]的減少也可以被檢測(cè)到。而這種輔酶的氧化物NAD(P)并不產(chǎn)生可見(jiàn)區(qū)內(nèi)的發(fā)射。這樣利用NAD(P)H圖譜就能夠得到細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和新陳代謝變化的信息。多光子層析成像能夠精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)皮膚深層成像,甚至能對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的線粒體成像。這樣就可以通過(guò)對(duì)自發(fā)熒光的分析檢測(cè)并區(qū)分細(xì)胞角質(zhì)化、基底干細(xì)胞、黑色素細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以及內(nèi)網(wǎng)的彈性纖維和膠原束。也可以對(duì)藥物和化妝品成分在皮膚下的擴(kuò)散進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。這樣無(wú)痛無(wú)創(chuàng)亞細(xì)胞層次分辨率的三維光學(xué)皮膚活檢即得以實(shí)現(xiàn)。4.2x/y-檢流計(jì)及熒光/shg成像技術(shù)要實(shí)現(xiàn)雙光子吸收過(guò)程,需要高強(qiáng)度近紅外光。在激發(fā)熒光的過(guò)程中,雙近紅外光子同時(shí)吸收,兩個(gè)光子共同提供激發(fā)所需要的能量。該能量總和等于熒光基團(tuán)在基態(tài)S0和激發(fā)后達(dá)到的電子能級(jí)S1之間的能量差。對(duì)于三光子吸收過(guò)程,同時(shí)吸收的是三個(gè)光子。高數(shù)值孔徑聚焦光路把低平均功率的激光在一個(gè)微小的焦點(diǎn)體積內(nèi)聚焦到所需要的高強(qiáng)度(圖7)。吸收和熒光/SHG激發(fā)都只發(fā)生在這個(gè)不到飛升的體積內(nèi)。這樣當(dāng)使用脈沖頻率高達(dá)兆赫茲到吉赫茲的飛秒激光器時(shí),平均功率只有幾毫瓦。從而在使用遠(yuǎn)紅外激光器時(shí)可以避免以往由較低的單光子內(nèi)部組織吸收系數(shù)導(dǎo)致的熱損傷、光漂白和失焦熒光/SHG激發(fā)。利用x,y方向上的檢流計(jì)掃描器和一組壓電驅(qū)動(dòng)聚焦光路,可以在三維空間內(nèi)以亞微米步進(jìn)的精度改變雙光子激發(fā)體積的位置。這就使無(wú)創(chuàng)深層組織光學(xué)切片能夠達(dá)到亞細(xì)胞的精度。通過(guò)在反掃描模式(熒光/SHG不通過(guò)光學(xué)掃描器)下采用無(wú)針孔檢測(cè)器,就可以實(shí)現(xiàn)具有較高光子采集效率和單光子靈敏度的三維成像。針對(duì)這一點(diǎn),圖像處理必須結(jié)合像素時(shí)鐘函數(shù)和x/y-檢流計(jì),z-壓電系統(tǒng)的幀同步信號(hào)。在雙光子層析成像中的標(biāo)準(zhǔn)激光光源應(yīng)當(dāng)是鎖模的鈦藍(lán)寶石激光器,工作可調(diào)波長(zhǎng)范圍在700~1000nm之間。這樣可以檢測(cè)到350~500nm的SHG信號(hào)和350~700nm的熒光信號(hào)。典型的熒光發(fā)光壽命一般在納秒級(jí)范圍內(nèi)。當(dāng)使用皮秒級(jí)上升時(shí)間的快速光子檢測(cè)器和時(shí)間相關(guān)的單光子計(jì)數(shù)技術(shù)時(shí),在時(shí)域內(nèi)的熒光衰減動(dòng)力學(xué)模型可達(dá)到較高的亞細(xì)胞空間精度。對(duì)衰減曲線進(jìn)行圖像處理可以得到每像素的平均熒光功率,對(duì)此進(jìn)行計(jì)算則會(huì)得到熒光壽命(FLIM)圖像。表1列出了臨床多光子層析中可檢測(cè)到的主要內(nèi)源皮膚熒光基團(tuán)和SHG活躍分子。最吸引人的熒光基團(tuán)是藍(lán)/綠發(fā)光輔酶NAD(P)H,這是一種通常情況下需要紫外光激發(fā)的基團(tuán)。由于紫外光的穿透深度淺,單光子技術(shù)不能實(shí)現(xiàn)對(duì)深層組織區(qū)域內(nèi)的該輔酶成像。然而,近紅外激光脈沖作用下的雙光子激發(fā)卻可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基底細(xì)胞層甚至皮內(nèi)細(xì)胞層細(xì)胞內(nèi)線粒體中的鈣該輔酶成像。有趣的是,用近紅外飛秒激光脈沖激發(fā)黑色素時(shí),發(fā)光最強(qiáng)的區(qū)域位于光譜中的黃/紅區(qū)域。卟啉類化合物,如糞卟啉和原卟啉,它們的熒光發(fā)光壽命長(zhǎng),從而可以在某些皮膚細(xì)菌(如丙酸菌座瘡)中或是采用了5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)處理過(guò)的線粒體中成像。熒光壽命是分子和其所處環(huán)境的一個(gè)特征參數(shù)。比方說(shuō),壽命分別為5.2,10~12和2~3ns的熒光分別對(duì)應(yīng)著自由黃素單核苷酸、原卟啉XI單體和二聚體。再比方說(shuō),自由NAD(P)H的熒光壽命只有0.3ns左右,而NADH的蛋白復(fù)合物的熒光壽命的標(biāo)準(zhǔn)值卻可以達(dá)到2ns。4.3皮膚和表皮的熒光內(nèi)部組織熒光基團(tuán)角蛋白主要存在于六角形的角化細(xì)胞中,這類角化細(xì)胞主要存在于外層角質(zhì)層(SC),平均直徑為(36±15)μm,而黑色素主要存在于頭發(fā)和基底細(xì)胞層中。角蛋白和黑色素能產(chǎn)生最強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。實(shí)際上,當(dāng)平均功率為2mW(25pJ脈沖能量)或者略小的激光就足可以在快速掃描模式下對(duì)SC和毛發(fā)內(nèi)部組織進(jìn)行光學(xué)切片(快速掃描模式的標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)為1frame/s,每幀512pixel×512pixel)。當(dāng)需要為內(nèi)部組織光學(xué)切片進(jìn)行基于雙光子NAD(P)H熒光的高分辨率成像時(shí),掃描速度要達(dá)到8frame/s,這是由平均光束駐留時(shí)間30ms/pixel決定的。對(duì)于深入成像,當(dāng)成像的組織深度為100μm(750nm波長(zhǎng))時(shí),入射激光功率通常為20~30mW。高分辨率成像可從整個(gè)表皮甚至真皮結(jié)構(gòu)中獲得。每個(gè)表皮細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)都可以清楚地呈現(xiàn)。無(wú)熒光的細(xì)胞核的精確位置和細(xì)胞分裂都可以成像,在系統(tǒng)的光學(xué)變焦下甚至可以看見(jiàn)單個(gè)組織內(nèi)的熒光線粒體(圖8)。真皮的光學(xué)切片使對(duì)單條彈性蛋白纖維、膠原質(zhì)結(jié)構(gòu)和毛細(xì)血管的觀測(cè)成為可能。通常情況下,參照聚焦光路的工作距離,監(jiān)測(cè)深度一般為200μm。外層角質(zhì)層的角質(zhì)化死細(xì)胞一般無(wú)核,扁平呈鱗狀,能有效阻擋外部化學(xué)物質(zhì)、微生物,并防止體內(nèi)水分流失。這一層“壁壘”可以轉(zhuǎn)化為10μm厚的顆粒層(SG)的顆粒,第一批活的角質(zhì)細(xì)胞死亡時(shí),這種轉(zhuǎn)化就可被檢測(cè)到了。在棘層(SS)中,利用細(xì)胞質(zhì)中的強(qiáng)熒光顆粒和無(wú)熒光的圓而大的核邊界,可以清楚地觀察到單一的角質(zhì)化細(xì)胞和它們的細(xì)胞室。細(xì)胞直徑隨著在組織中位置的深入從(26±3)μm減少到(16±4)μm。對(duì)表皮細(xì)胞層的最底層,也就是基底層(SB)的檢測(cè)是利用對(duì)基底角質(zhì)干細(xì)胞[直徑為(9±1)μm]的強(qiáng)熒光的監(jiān)測(cè)實(shí)現(xiàn)的。這些細(xì)胞通常都會(huì)在一個(gè)月的時(shí)間遷移到皮膚表面,并在這個(gè)過(guò)程中逐漸分化。而在牛皮癬的病例中,細(xì)胞分裂和遷移到皮膚表層的兩個(gè)過(guò)程分別只用了36h和4天的時(shí)間,角質(zhì)化細(xì)胞中的90%都是表皮細(xì)胞。真皮和表皮之間轉(zhuǎn)化的深度通常是變化的,由乳頭狀突起決定。女性實(shí)驗(yàn)對(duì)象的轉(zhuǎn)化深度通常在55~70μm,而男性則為70~100μm。結(jié)締組織,特別在厚度小于1μm的單條長(zhǎng)熒光彈性纖維可以由自發(fā)熒光清楚地呈現(xiàn)。膠原蛋白結(jié)構(gòu)的自發(fā)熒光通常較弱,然而,雖然檢測(cè)方向是反向的,但SHG信號(hào)更強(qiáng)。SHG最初是和光束方向同向,但是在多次散射后就不再遵循原方向?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的膠原類型有28種。在皮膚中,存在著第一類膠原和它的三螺旋體。通常情況下,從時(shí)間分辨的單光子計(jì)數(shù)測(cè)量中可以得到每個(gè)體元的雙指數(shù)曲線(振幅A1,A2,熒光壽命τ1,τ2,平均熒光壽命t)。短曲線的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間在檢測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間以內(nèi),很可能是SHG信號(hào),少量的散射光和一些快速衰退的熒光基團(tuán),比如說(shuō)黑色素。長(zhǎng)一些的曲線源自自發(fā)熒光,通常對(duì)于內(nèi)組織細(xì)胞在1.8~2.4ns的量級(jí)上。因?yàn)閭尾噬幋a和亮度有關(guān),所以在空間分辨的FLIM中可以獲得四維信息(圖9)。FLIM已經(jīng)用于研究黑色素的不同類別和染發(fā)物質(zhì)在頭發(fā)中的積累過(guò)程。單光子技術(shù)也被用于獲取皮膚年齡。在這種應(yīng)用里,膠原的彈性系數(shù)可由雙光子彈性蛋白的自發(fā)熒光和SHG測(cè)定。實(shí)際上,帶通濾波不同的雙SPC檢測(cè)器結(jié)合到分束器的前方,分束器可將短波SHG信號(hào)和熒光長(zhǎng)波信號(hào)分離,而SPC檢測(cè)器和分束器結(jié)合后,可以在800nm左右的激發(fā)光狀態(tài)下同時(shí)工作。真皮二次諧波-熒光老化指數(shù)(SAAID),或者稱作比率,反應(yīng)了皮膚的年齡。測(cè)量體內(nèi)SAAID可以揭示40歲以上婦女比同齡男性更快衰老的機(jī)理以及吸煙對(duì)人體的影響。5圖像中的石頭5.1點(diǎn)頭成像技術(shù)phOCT技術(shù)是第一種以相干為特性的醫(yī)學(xué)成像技術(shù),其理論基礎(chǔ)是早期的白光干涉測(cè)量法,起源于最初用作網(wǎng)絡(luò)故障檢測(cè)的光學(xué)相干域反射測(cè)量技術(shù)(OCDR)。OCDR原本用于檢測(cè)光纜的瑕疵,但不久人們就認(rèn)識(shí)到它具有探測(cè)眼睛和其他生物組織的能力。OCT概念的首次提出是在1991年,美國(guó)麻省理工大學(xué)的Huang等采用OCT技術(shù)成功地對(duì)人眼視網(wǎng)膜的細(xì)微結(jié)構(gòu)和動(dòng)脈壁成像。1993年,演示了人類視網(wǎng)膜的活體光學(xué)相干層析成像。1995年,開(kāi)始眼科的臨床研究。短短10年間,OCT迅速發(fā)展起來(lái),在分辨率和性能上有了很大的提高,并由此拓展出多種成像模式,如多普勒OCT(ODT),偏振敏感型OCT(PS-OCT),光譜OCT,差分吸收型OCT和與雙光子熒光或超聲結(jié)合的OCT技術(shù),并在同內(nèi)窺鏡結(jié)合的方式中實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)部器官的斷層成像。這些不同模式的成像為從微觀上更好地觀察組織結(jié)構(gòu),了解其生理功能提供了手段。5.2典型的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖10所示,OCT總體系統(tǒng)主要由低相干光源、干涉儀、光學(xué)掃描機(jī)構(gòu)組成。5.2.1增設(shè)ph的源泉在首次對(duì)人眼視網(wǎng)膜成像的示范中,使用了850nm的超發(fā)光二極管(SLD),它對(duì)眼球的玻璃體和視網(wǎng)膜都有很好的穿透能力。而對(duì)于其他人體組織,由于高散射特性加強(qiáng)了光的衰減,因此還需要新的光源來(lái)提高穿透力。評(píng)價(jià)適于OCT成像的光源有4個(gè)主要指標(biāo):波長(zhǎng)、帶寬、單傳播模式和穩(wěn)定性。其次從光源的應(yīng)用角度考慮,應(yīng)著重于使用方便,易于攜帶,兼容性好。因?yàn)槎滩ㄩL(zhǎng)的光(如藍(lán)光),它的光子在組織中的平均散射路徑短,不能滿足OCT的軸向探測(cè)深度,所以O(shè)CT光源一般采用近紅外光。另一方面,水分子對(duì)2μm左右波長(zhǎng)的光有較強(qiáng)吸收,因此OCT的工作波段在1.2~1.8μm之間為最佳。5.2.2模擬的間濾波器、反射鏡的應(yīng)用和完善的光纖式多通道光耦合技術(shù)OCT系統(tǒng)的核心在它的干涉儀部分。典型的干涉結(jié)構(gòu)是基于光纖的Michelson干涉儀,如圖11所示,在這種結(jié)構(gòu)中,光源發(fā)出的光通過(guò)單模光纖傳輸,在耦合器處被分為兩束光,其中一束由另一根單模光纖傳至參考鏡。而原光纖傳輸?shù)哪鞘鴦t進(jìn)入樣品臂。樣品臂的光纖末梢有兩個(gè)作用:其一作為相干光的收發(fā)器,其二可作為類似于共焦針孔的空間濾波器。但是這種結(jié)構(gòu)的一個(gè)缺點(diǎn)就是從參考臂返回的直流信號(hào)和強(qiáng)度噪聲都加載到干涉信號(hào)上了。圖11(b)和(c)中的對(duì)稱結(jié)構(gòu)利用兩個(gè)光電探測(cè)器所得的光電流相減方法來(lái)消除背景噪聲,增強(qiáng)了干涉信號(hào)。圖11(c)的馬赫-曾德?tīng)柦Y(jié)構(gòu)可用于反射模式也可用于傳輸模式。在OCT系統(tǒng)中使用光纖有很多方便的地方,但不是必需的。實(shí)際上在許多應(yīng)用場(chǎng)合中,分離式干涉儀有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。各式棱鏡和反射鏡的應(yīng)用給干涉儀的設(shè)計(jì)增加了靈活性,尤其在樣品臂和參考臂的光耦合問(wèn)題上。因?yàn)樵S多單模光纖都是由硅這種雙折射材料做成的,光纖彎曲會(huì)引起光束偏振態(tài)的改變,因此在光纖式OCT系統(tǒng)中經(jīng)常要加上調(diào)整光偏振態(tài)的調(diào)制器。空間分離式干涉儀結(jié)構(gòu)則可避免這些問(wèn)題。圖11(d)~(f)列出了幾種可能用于OCT系統(tǒng)的分離式干涉儀結(jié)構(gòu)。圖11(a)的結(jié)構(gòu)等價(jià)于邁克耳孫干涉儀,用分束器替代了2×2光纖耦合器。圖11(e)的結(jié)構(gòu)可以將半導(dǎo)體光源和探測(cè)器結(jié)合用于手握式掃描儀使結(jié)構(gòu)更緊湊。此種結(jié)構(gòu)的干涉儀可容易地解決偏振態(tài)問(wèn)題和參考臂與樣品臂之間的散射不匹配問(wèn)題。圖11(f)等效于馬赫-曾德?tīng)柟饫w結(jié)構(gòu)。5.2.3維/三維層析圖像軸向的掃描方式從OCT成像原理分析,為測(cè)量出樣品軸向深度方向的各點(diǎn)信息,與它做干涉的參考臂就需要改變其長(zhǎng)度以匹配樣品臂的光程,通過(guò)得到干涉的等光程點(diǎn)獲得樣品信息。即OCT系統(tǒng)所構(gòu)成的二維/三維層析圖像軸向深度的測(cè)量是通過(guò)掃描參考臂得到的,因此OCT的圖像質(zhì)量與參考臂的掃描有直接關(guān)系。掃描方式是利用各種光學(xué)延時(shí)線改變兩臂的光程差。對(duì)于參考臂的掃描,首先要求路徑必須是在一個(gè)有限范圍內(nèi)變化以覆蓋成像所需的軸向長(zhǎng)度,對(duì)于眼睛成像路徑要大于2cm,對(duì)于皮膚和其他高散射組織則為2mm;其次,掃描定位精度必須小于光源的相干長(zhǎng)度。5.3皮膚組織結(jié)構(gòu)、組織形態(tài)、優(yōu)點(diǎn)OCT圖像顯示的是皮膚結(jié)構(gòu)的縱斷面,與皮膚CT的皮膚橫斷面成像不同,而與皮膚組織病理相同,符合傳統(tǒng)的觀察習(xí)慣。由于皮膚紋理的存在,皮膚表面呈現(xiàn)波浪形,皮膚對(duì)光的反射導(dǎo)致其表面呈現(xiàn)明亮的強(qiáng)信號(hào)帶,在這個(gè)信號(hào)帶下面,可見(jiàn)分層結(jié)構(gòu)。角質(zhì)層皮膚最為表淺,表現(xiàn)為低散射帶,境界清楚,僅在掌跖皮膚處明顯可見(jiàn),較厚,如指尖皮膚角質(zhì)層平均厚度約300μm,而其下方表皮厚度僅為100μm。角質(zhì)層內(nèi)部還可見(jiàn)一些螺旋形汗腺導(dǎo)管,表現(xiàn)為高度散射(圖12)。角質(zhì)層和其下方表皮組織界限分明,如箭頭所示為顆粒層,而真表皮交界常模糊不清。在掌跖以外的其他部位皮膚,角質(zhì)層下方的表皮是OCT圖像第一層(圖13),表皮信號(hào)弱于真皮層,如果真表皮交界平坦,易于與上層真皮區(qū)分開(kāi)來(lái)。真皮常表現(xiàn)為信號(hào)較強(qiáng),而其內(nèi)的管腔如血管等的信號(hào)弱(圖13),呈現(xiàn)無(wú)信號(hào)圓形或長(zhǎng)形結(jié)構(gòu)。真皮內(nèi)還存在一些低散射區(qū),代表毛囊和皮脂腺(圖14)。此外,較薄的真皮下部也可見(jiàn)低反射的皮下結(jié)構(gòu),皮膚表面毛發(fā)可引起信號(hào)陰影。除了表皮或真皮結(jié)構(gòu),OCT還可用于人類指甲的成像,較高分辨率的OCT證實(shí)了雙層狀結(jié)構(gòu)的存在。實(shí)際應(yīng)用中注意到OCT成像受皮膚不同生理狀況的影響,角質(zhì)層厚度不影響其深層組織的光學(xué)特性,而黑素可輕微減少真皮中的信號(hào)強(qiáng)度,紅斑和水腫可減少光衰減。OCT可對(duì)正常皮膚的厚度進(jìn)行測(cè)量。簡(jiǎn)單的測(cè)量方法是通過(guò)普通A掃描和B掃描進(jìn)行。在普通A掃描中第二個(gè)峰代表真表皮交界,而第2個(gè)反射層是由于光在真皮膠原纖維中的后向散射所致,通過(guò)測(cè)量峰與峰之間的距離可估計(jì)表皮的厚度。B掃描也可測(cè)量表皮的厚度,通過(guò)測(cè)量工具測(cè)量從皮膚表面反射即入射信號(hào)到第一個(gè)界清反射面的距離而獲得。為增加OCT成像在皮膚中的穿透深度和改善OCT成像的對(duì)比度,甘油、丙二醇等高滲性物質(zhì)作為透光劑已應(yīng)用于OCT成像領(lǐng)域(圖15),透光劑可影響皮膚的光散射性質(zhì),導(dǎo)致光衰減的降低,使真皮變得透明,從而增加了OCT光信號(hào)的檢測(cè)深度。透光劑引起的皮膚組織的透明效應(yīng)是由于這些物質(zhì)的高滲透性引起水從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外移動(dòng),導(dǎo)致了膠原和基質(zhì)的折射指數(shù)改變。但甘油對(duì)角質(zhì)層的作用是不同的,該物質(zhì)是自然保濕因子,增加角質(zhì)層結(jié)合水的能力,降低角質(zhì)層的不透明性。傳統(tǒng)的OCT橫向分辨率為10~15μm,常能鑒別掌跖角質(zhì)層、表皮和上層真皮及皮膚附屬器和血管。理論上超高圖像分辨率約1μm的技術(shù)才可能研究細(xì)胞水平的變化,但超高分辨率成像在高度混濁的介質(zhì)如皮膚中仍是一個(gè)技術(shù)問(wèn)題,高輸出寬帶光源如飛秒激光在不遠(yuǎn)的將來(lái)可能解決這個(gè)問(wèn)題。除了高分辨形態(tài)學(xué)研究,常規(guī)OCT應(yīng)用局部物理學(xué)參數(shù)可研究組織特征,在美容和藥物工業(yè)中得到青睞,基于光譜分析、組織雙折射和多普勒血流的功能性O(shè)CT成像在皮膚科領(lǐng)域也已取得顯著的進(jìn)展?？傊?OCT不能完全取代活檢組織學(xué)或其他診斷手段,但從對(duì)疾病非損傷診斷及監(jiān)測(cè)治療效應(yīng)角度,OCT能發(fā)揮重要的輔助作用。6光色調(diào)成像6.1生物組織無(wú)損檢測(cè)技術(shù)對(duì)生物組織進(jìn)行成像,是研究生物組織的結(jié)構(gòu)特征、功能及醫(yī)學(xué)臨床診斷的重要手段。光聲層析成像(PAT)是近年來(lái)迅速發(fā)展的一種新的無(wú)損醫(yī)學(xué)成像方法,該技術(shù)結(jié)合了組