敗醬草提取物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織nf-、il-1和il-10的影響

敗醬草提取物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織nf-、il-1和il-10的影響

濕草是指濕科多年生草本植物的黃花濕草和白色總草。具有清熱解毒、排膿止痛、活血化瘀、活血化瘀的功效。臨床常用于慢性胃炎、胃食管反流、放射性直腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎等。筆者前期藥理研究結(jié)果顯示敗醬草可升高UC大鼠SOD值,降低MDA值,降低MPO活性,從而改善或減輕潰瘍性結(jié)腸炎癥狀。潰瘍性結(jié)腸炎的病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確,目前研究認(rèn)為許多細(xì)胞因子和相關(guān)基因與其關(guān)系最為密切。促炎細(xì)胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ等)與抗炎細(xì)胞因子(如IL-10、TGF-β等)水平之間的比例失調(diào)目前被視為IBD的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制。本研究在以往研究工作的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步觀察敗醬草對(duì)UC大鼠結(jié)腸腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-10表達(dá)的影響,探討其對(duì)IBD的可能作用機(jī)制。1材料和機(jī)器1.1藥物、試劑和儀器敗醬草藥材(購(gòu)自)廣州市藥材公司,經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院王鳳云老師鑒定為敗醬科(Valerianaceae)敗醬屬(Patrinia)植物黃花敗醬(PatriniaScabioscaefoliaFisch)的帶根全草。敗醬草提取物(自制,含量為1.2g原生藥/mL);TNBS由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn),批號(hào)為090M5000,購(gòu)自上海Sigma-Aldrich生物技術(shù)有限公司;巴柳氮鈉片,規(guī)格:0.5g/片,山西安特生物制藥股份有限公司生產(chǎn),國(guó)藥準(zhǔn)字H20041706;水合氯醛由天津科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),批號(hào)為20090922;AR級(jí)無水乙醇由天津大茂化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn),批號(hào)為20090318;大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒為美國(guó)BD公司產(chǎn)品,由上海寶生物科技有限公司進(jìn)口分裝。1.2研究動(dòng)物SD大鼠40只,雌雄各半,體重180～220g,購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào)SCXK(粵)2008-0002,試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。1.3熒光生物顯微鏡成像系統(tǒng)電子分析天平(型號(hào)為FA1004)為上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫箱(型號(hào):HPX-9052MBE)為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;RM2135型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、EG1140石蠟包埋機(jī)、HI1210攤片機(jī)、HI1220烘干機(jī),德國(guó)徠卡公司;全自動(dòng)生化分析儀,意大利ECHO公司;LeicaDMR高級(jí)研究型熒光生物顯微鏡成像系統(tǒng),德國(guó)Leica公司;多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)perkinElmer公司;HC-3618R高速冷凍離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;一次性無菌注射器,手術(shù)器械等。2方法2.1提取制備生藥液制備取敗醬草100g,加1000mL蒸餾水浸泡2h后,回流提取2次,合并提取液,濃縮至200mL,過濾,濾液置冰箱中冷藏(0.5g生藥/mL)。用研缽將巴柳氮鈉片研成細(xì)末,用0.5%的羧甲基纖維素鈉配成藥物濃度為0.1g/mL的溶液。2.2造模和損害是否會(huì)是大鼠的模型將40只大鼠隨機(jī)分成4組,每組10只:正常組、模型組、敗醬草組和巴柳氮組,除正常組外,其余各組大鼠禁食不禁水24h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,用大鼠灌胃針管由肛門緩慢插入8cm,模型組、敗醬草組、巴柳氮組推入造模溶液(使用50%乙醇0.25mL配成的100mg/kgTNBS),正常組給予同體積生理鹽水灌腸,各組大鼠倒立30s后,仰臥放回籠子。灌腸24h后,正常組及模型組灌胃生理鹽水10mL/kg·d,敗醬草組灌胃敗醬草水煎液4mL/kg·d,巴柳氮組灌胃巴柳氮鈉水溶液10mL/kg·d(即巴柳氮鈉1g/kg,大鼠給藥量為成人臨床劑量10倍)灌胃,連續(xù)10d。2.3樣品采集灌胃治療結(jié)束后,禁食24h,頸椎脫臼處死所有大鼠,開腹腔迅速取出結(jié)腸,沿縱軸切開,生理鹽水迅速?zèng)_洗干凈,置于10%甲醛溶液中固定。2.4腸組織病理學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)本固定,常規(guī)石蠟包埋,切片、HE染色、光鏡觀察,參考文獻(xiàn)進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分。2.5elisa法檢測(cè)bs緩沖液中tnf-、il-1、il-10的水平每只大鼠稱取結(jié)腸組織200mg,放入試管,再加9倍體積冰冷PBS緩沖液(pH7.4)冰浴勻漿,融凍2次,低溫離心機(jī)4℃3000r/min離心10min,取上清,采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)上清TNF-α、IL-1β、IL-10的水平。2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件spss13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),組間差異比較用LSD-t(方差相齊)、Tamhane’sT2(方差不齊)。3結(jié)果3.1低血肉中染正常組大鼠結(jié)腸鏡下觀察組織形態(tài)正常,結(jié)腸壁各層結(jié)構(gòu)清晰,未見水腫、糜爛及潰瘍,間質(zhì)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠結(jié)腸組織可見黏膜層、黏膜下層廣泛潰瘍形成,中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),腺體破壞,結(jié)構(gòu)紊亂,杯狀細(xì)胞減少,隱窩結(jié)構(gòu)扭曲,隱窩炎癥及膿腫形成。經(jīng)藥物干預(yù)后,敗醬草組、巴柳氮組大鼠結(jié)腸組織可見病變明顯比模型組病輕,潰瘍愈合,隱窩膿腫消失,充血水腫明顯減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。所有造模組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著高于正常組(P<0.01),敗醬草組、巴柳氮組較模型組顯著下降(P<0.01),但兩治療組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。3.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與正常組相比,模型組大鼠結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1、IL-10水平顯著升高,有極顯著性意義(P<0.01),但兩治療組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比,兩治療組大鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1、IL-10水平顯著下降(P<0.01)。兩治療組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。與正常組相比,模型組、敗醬草組動(dòng)物的結(jié)腸組織IL-10水平顯著升高(P<0.01),巴柳氮組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較,巴柳氮組大鼠結(jié)腸組織IL-10水平顯著下降(P<0.01),敗醬草組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。敗醬草組大鼠結(jié)腸組織IL-10水平顯著高于巴柳氮組(P<0.01,見表1)。4tnf-抑制劑研究發(fā)現(xiàn),與模型組比較,敗醬草組大鼠組織病理?yè)p傷減輕,效果與陽(yáng)性巴柳氮鈉組類似。TNF-α和IL-1β是UC發(fā)病機(jī)制中重要的促炎介質(zhì):促炎細(xì)胞因子IL-lβ可上調(diào)免疫因子并促炎癥活性;促炎細(xì)胞因子TNF-α可使內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子水平升高并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集。本研究發(fā)現(xiàn),TNBS造模大鼠結(jié)腸組織IL-1β和TNF-α表達(dá)水平明顯升高,敗醬草干預(yù)后兩個(gè)促炎細(xì)胞因子水平下調(diào)。IL-10通過抑制激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和T細(xì)胞發(fā)揮有效功能。對(duì)于TNBS誘導(dǎo)的鼠結(jié)腸炎,經(jīng)巴柳氮或敗醬草治療后,