米氏凱倫藻溶血毒素溶血反應(yīng)特征研究

米氏凱倫藻溶血毒素溶血反應(yīng)特征研究

馬齊莫利亞斯坦是典型的紅藻。這是世界上廣泛分布的物種，經(jīng)常出現(xiàn)在溫帶和海拔高度較多的水域。根據(jù)現(xiàn)有的赤潮評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),米氏凱倫藻細(xì)胞密度達(dá)到106cellsL-1以上時(shí),即可形成米氏凱倫藻赤潮。自從1986年廈門西港區(qū)發(fā)生疑似米氏凱倫藻赤潮以來,米氏凱倫藻赤潮在我國頻繁爆發(fā),造成了養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重?fù)p失。1998年,珠江口海域發(fā)生的米氏凱倫藻赤潮給粵港兩地的海水養(yǎng)殖業(yè)造成毀滅性打擊,直接經(jīng)濟(jì)損失3.5億元。此后幾年間,中國廣大海域也經(jīng)常發(fā)生生態(tài)危害嚴(yán)重、經(jīng)濟(jì)損失慘重的米氏凱倫藻赤潮。迄今為止關(guān)于赤潮發(fā)生的機(jī)制尚無定論,但是目前的大多數(shù)研究者比較贊同的觀點(diǎn)是:赤潮生物的存在是形成赤潮的內(nèi)因;環(huán)境因素(溫度、鹽度、海水富營養(yǎng)化和氣候等)的突變是其形成的外因。而環(huán)境因素是否也對(duì)赤潮藻次生代謝物的特性有所影響,目前研究還比較少。彭喜春等已發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子對(duì)球形棕囊藻溶血毒素的活性影響比較大,從而直接影響赤潮的危害。而米氏凱倫藻次生代謝物是否也受環(huán)境因子影響,目前不得而知,本文就此進(jìn)行研究。米氏凱倫藻產(chǎn)生的溶血毒素可能是造成魚類大量死亡的主要原因之一。雖然其成分和結(jié)構(gòu)還不是十分清楚,但研究顯示糖脂和不飽和脂肪酸可能是其主要組份。Matthew等報(bào)道,米氏凱倫藻中的一種游離不飽和脂肪酸和二半乳糖基單酰甘油能使魚致死。Yasumoto等指出,米氏凱倫藻溶血毒素是一種含有兩個(gè)不飽和脂肪酸的糖基二乙?；视?水解之后可產(chǎn)生一個(gè)去糖基甘油酯(lysoglycoglycerolipid)和一個(gè)多不飽和脂肪酸;米氏凱倫藻中溶血活性最高的物質(zhì)是octadecapen-taenoicacid(18:5n-3,OPA)。Parrish等指出,米氏凱倫藻中的單半乳糖甘油二酯和雙半乳糖甘油二酯具有溶血毒性。另外還有報(bào)道,一種來自米氏凱倫藻赤潮的特性不明的溶血毒素對(duì)長須鯨(Balaenopteraphysalus)鰓的上皮細(xì)胞能造成嚴(yán)重的損害,導(dǎo)致深海無脊椎動(dòng)物的死亡。王朝暉等指出,溶血毒素可造成魚鰓鰓小葉上皮細(xì)胞增生、鄰近鰓小葉粘連、上皮細(xì)胞脫落、鰓血管破裂、血細(xì)胞滲出等病理現(xiàn)象,進(jìn)一步引致魚類呼吸困難,導(dǎo)致魚類死亡;藻密度過大引致鰓組織堵塞缺氧并非米氏凱倫藻赤潮引起魚類死亡的主要原因。目前,針對(duì)米氏凱倫藻溶血毒素的研究多集中在其成分的分析和鑒定等方面,有關(guān)溶血反應(yīng)特征的研究尚未見報(bào)道。本文擬通過溫度、pH值、二價(jià)陽離子等對(duì)米氏凱倫藻溶血毒素溶血活性的影響分析等,探討米氏凱倫藻溶血毒素的溶血特征,以期為進(jìn)一步闡明米氏凱倫藻溶血毒素的溶血機(jī)制、正確評(píng)價(jià)和認(rèn)識(shí)米氏凱倫藻赤潮的危害提供參考和依據(jù)。1材料和方法1.1藻類藻類米氏凱倫藻(KareniamikimotoiHasen)由暨南大學(xué)呂頌輝教授提供,分離自中國南海赤潮高發(fā)區(qū)。1.2藻細(xì)胞生長特性米氏凱倫藻的培養(yǎng)采用f/2培養(yǎng)基。培養(yǎng)基按照Guillard1962年改良配方配制,并用孔徑0.22μm纖維濾膜除菌得到。取對(duì)數(shù)生長末期的米氏凱倫藻,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并計(jì)算其細(xì)胞密度后接種,接種密度約為5.51×106cellsL-1,接種后置于LRH-250-GS型人工光照氣候箱(廣東省醫(yī)療器械廠)中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度20±1℃,光照強(qiáng)度為200μmolm-2s-1,光暗循環(huán)為L:D=12:12。每天固定時(shí)間取樣于顯微鏡下計(jì)數(shù),繪制藻細(xì)胞的生長曲線。根據(jù)公式μ=(InN2-InN1)/(t2-t1)計(jì)算比生長率,其中t1、t2為培養(yǎng)時(shí)間;N1和N2分別為培養(yǎng)t1、t2時(shí)間的細(xì)胞密度。1.3超聲波細(xì)胞破碎法取對(duì)數(shù)生長期末期的藻液,分批于2000×g離心10min收集藻細(xì)胞,置于氯仿:甲醇:水=13:7:5(v/v)的混和溶液中;用JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)于4℃破碎30min。儀器參數(shù)設(shè)置為:功率200W,破碎時(shí)間5s,間隔時(shí)間5s;破碎后于分液漏斗中靜置,待完全分層后取下層溶液,去除溶劑后溶解于適量的甲醇中(甲醇的量為培養(yǎng)液的2/1000),即得到粗提的溶血毒素。1.4待測(cè)毒素以洋地黃皂甙為溶血毒素標(biāo)準(zhǔn),檸檬酸緩沖液(pH7.0)處理的0.5%(v/v)的新鮮兔血紅細(xì)胞為材料,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100μL待測(cè)毒素溶液,用檸檬酸等酸緩沖液補(bǔ)充至400μL,再加入0.5%的紅細(xì)胞溶液1600μL于37℃反應(yīng)30min,350×g離心5min。取上清液用Goldspectrumlab53紫外可見分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)檢測(cè)其吸光度值OD540nm,計(jì)算溶血百分?jǐn)?shù)。設(shè)不含毒素的甲醇作為對(duì)照。1.5不同因素對(duì)溶血活性的影響1.5.1吸光值檢測(cè)反應(yīng)體系:100μL毒素溶液,300μLpH值為7的檸檬酸等滲緩沖液和0.5%的紅細(xì)胞溶液1600μL(100μL甲醇為對(duì)照),于0℃、4℃、20℃和37℃下反應(yīng),每隔10min,檢測(cè)其吸光值。每個(gè)溫度測(cè)定3次,檢測(cè)方法同上。1.5.2吸光度測(cè)定取100μL毒素溶液,1600μLpH值分別為4、5、6、7、8和9的0.5%的紅細(xì)胞溶液和300μL相應(yīng)pH值的檸檬酸等滲緩沖液(100μL甲醇為對(duì)照),于37℃反應(yīng),每隔10min,測(cè)定吸光值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)定3次,檢測(cè)方法同上。1.5.3溶液活性的測(cè)定于紅血球懸浮液中分別加入一定量的MgC12、CaC12、MnC12、CoC12、ZnSO4、CuSO4和HgC12,使終濃度為5mmol/L。溶血活性的檢測(cè)方法同上。另外,實(shí)驗(yàn)中測(cè)定了不同濃度的Hg2+對(duì)溶血作用的影響,以及EDTA對(duì)HgC12抑制溶血作用的影響。加入毒素20min后加入lmmol/L的HgC12,繼續(xù)反應(yīng)10min,然后加入5mmol/L的EDTA。觀察其溶血活性的變化。2結(jié)果和討論2.1藻細(xì)胞衰亡期圖1為米氏凱倫藻的生長曲線?？芍?米氏凱倫藻經(jīng)過2～3d的延滯期后,細(xì)胞開始快速分裂,細(xì)胞數(shù)目呈對(duì)數(shù)增加,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。26d后藻細(xì)胞衰亡的速度開始大于分裂的速度,總體細(xì)胞數(shù)目變少,進(jìn)入衰亡期。在對(duì)數(shù)生長期米氏凱倫藻的比生長率μ平均為0.0495d-1,以第5天最高,達(dá)0.249d-1,比呂頌輝等以NO3-N為氮源,CN/CP=16時(shí)米氏凱倫藻的生長率小。這可能與實(shí)驗(yàn)中藻的初始密度、培養(yǎng)溫度和光照等環(huán)境條件不同有關(guān)。2.2胞中溶血活性測(cè)定米氏凱倫藻溶血活性為64.69±6.43HUL-1,單個(gè)細(xì)胞中的溶血活性為6.17±0.61×10-6HU,明顯高于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的球形棕囊藻和何家菀野外采集的球形棕囊藻的溶血活性。這可能是造成米氏凱倫藻比球形棕囊藻魚毒性更強(qiáng)、造成損失更大的原因之一。2.3米氏凱倫藻的溶血活性圖2為溫度對(duì)米氏凱倫藻溶血活性的影響?？梢钥闯?隨溫度的升高,溶血活性逐漸增強(qiáng)。0℃時(shí),隨時(shí)間的延長,溶血活性基本維持不變,維持在10%左右;4℃、20℃和37℃時(shí),溶血活性隨時(shí)間的延長逐漸增加。這一結(jié)果與棕囊藻溶血毒素的相似。目前有關(guān)米氏凱倫藻溶血毒素的結(jié)構(gòu)尚不十分清楚。但初步研究表明,其主要組分可能是糖脂和不飽和脂肪酸。其分子中含有一個(gè)親水端和一條疏水鏈,類似于非離子型表面活性劑。非離子型表面活性劑的溶血活性與其臨界膠態(tài)濃度(criticalmicelleconcentration,CMC)成反比。隨溫度升高CMC降低。因此,可以認(rèn)為米氏凱倫藻溶血活性隨溫度的變化與其非離子型表面活性劑的結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。從海水四季的表層溫度來看:在春、冬季,緯度比較高的海域,如渤海、黃海表層平均水溫約10℃左右,且緯度越高,溫度越低;而緯度比較低的海域,如東海、南海表層水溫可大于20℃,且緯度越低,溫度越高;夏季和秋季也存在這種情況,所不同的是都可以達(dá)到較高溫度,如南部海域可以達(dá)到30℃左右。因此我們可以推測(cè)南海水域爆發(fā)米氏凱倫藻赤潮引起的危害可能大于其他海域。從圖3可以看出,不同pH條件下米氏凱倫藻溶血毒素的溶血活性明顯不同,其中pH6.0時(shí)的最高,pH4.0時(shí)的最低,pH5.0、7.0、8.0和9.0時(shí)比較接近。這與球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)和小定鞭藻(Prymnesiumparvum)的情況有差異,說明米氏凱倫藻溶血毒素的親水端與棕囊藻不同。一般來說,海水pH值在8.0～9.0左右;入?？?特別是有污染的入?？诨蚋蹫称鋚H值比較低,接近6.0。因此,推測(cè)入?？诎l(fā)生米氏凱倫藻赤潮危害的可能更大。從圖4可以看出,大部分二價(jià)陽離子抑制溶血毒素的溶血活性,其中Hg2+的抑制作用最強(qiáng),幾乎可完全抑制其活性;其他離子的抑制作用大小為Cu2+>Mg2+>Mn2+>Ca2+>Co2+>Zn2+。為進(jìn)一步闡明Hg2+抑制米氏凱倫藻溶血活性的機(jī)制,我們比較了不同濃度Hg2+的溶血活性及EDTA的影響。從圖5可以看出,[Hg2+]=1mmol/L時(shí),溶血百分?jǐn)?shù)幾乎為0;[Hg2+]=5mmol/L時(shí),溶血百分?jǐn)?shù)恒定為0,此時(shí)紅細(xì)胞已完全聚集沉淀。而[Hg2+]=0.1mmol/L時(shí),1h后溶血百分?jǐn)?shù)為42.23%;同時(shí)加入100μL毒素和0.1mmol/L的Hg2+,37℃反應(yīng)10min后,溶血百分?jǐn)?shù)達(dá)67.13%,這遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于100μL毒素的溶血百分?jǐn)?shù)(42.98%),這表明低濃度的Hg2+可以促進(jìn)溶血。Zolla等研究汞離子對(duì)人血紅細(xì)胞的影響時(shí),也觀察到這種現(xiàn)象,當(dāng)[Hg2+]>0.25mmol/L時(shí),血紅細(xì)胞開始產(chǎn)生快速的聚集反應(yīng),從而阻止了Hg2+誘導(dǎo)的溶血反應(yīng);0.1mmol/L<[Hg2+]<0.25mmol/L時(shí),可導(dǎo)致溶血反應(yīng)。從圖5還可看出,加入100μL毒素反應(yīng)20min后,溶血百分?jǐn)?shù)接近50%,此時(shí)加入1mmol/L的Hg2+反應(yīng)10min,溶血百分?jǐn)?shù)仍維持在50%左右,而對(duì)照組則增加到56.71%,表明1mmol/L的Hg2+能夠有效阻止正在進(jìn)行的溶血反應(yīng)。隨后加入5mmol/L的EDTA,溶血百分?jǐn)?shù)開始明顯增加,60min時(shí)溶血百分?jǐn)?shù)已達(dá)到71.37%,表明EDTA能完全消除Hg2+對(duì)溶血過程的抑制作用。彭喜春等在研究球形棕囊藻溶血活性時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。許多研究報(bào)道,不同雙親分子的溶血反應(yīng)機(jī)制不同,大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能在生物膜表面形成離子通道,而皂甙類表面活性物質(zhì)直接能與膜脂分子作用。高濃度的Hg2+對(duì)米氏凱倫藻溶血活性具有強(qiáng)烈的抑制作用,幾乎能完全抑制溶血反應(yīng),且能抑制正在進(jìn)行的溶血反應(yīng)。說明1mmol/L的Hg2+能夠使兔血紅細(xì)胞凝聚成團(tuán),這種凝聚作