第十單元 免疫缺陷性疾病的免疫學(xué)檢測

第十單元免疫缺陷性疾病的免疫學(xué)檢測

實驗一HIV抗體初篩實驗獲得性免疫缺陷綜合征

是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染所引起的以CD4+T細胞減少為主要特征，同時伴反復(fù)機會感染、惡性腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的一組綜合征。HIV感染的免疫學(xué)檢驗方法主要針對病毒抗原和抗病毒抗體的檢測以及免疫細胞數(shù)量和功能的分析。HIV抗體初篩實驗主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗、快速檢測試驗（明膠顆粒凝集試驗、免疫滲濾試驗和免疫層析試驗）等。ELISA是最常用的HIV抗體初篩實驗方法。本實驗采用雙抗原夾心ELISA法檢測人血清中HIV抗體。檢測方法在符合Ⅱ級生物安全實驗室（BSL-2）要求的艾滋病檢測實驗室中進行。實驗條件將HIV抗原包被于固相載體，加入待檢樣品和酶標記的HIV抗原，形成抗原－抗體－酶標抗原復(fù)合物，洗滌，加底物顯色。通過酶標儀檢測吸光度A450nm值，根據(jù)A450nm值判斷HIV抗體的存在與否。實驗原理1.HIV抗原酶標板。2.洗滌液PBS-Tween20。3.辣根過氧化物酶標記的HIV抗原。4.辣根過氧化物酶底物溶液。5.底物稀釋液PBS-1%BSA。6.終止液2mol/lH2SO4溶液。7.對照血清臨床標本篩選獲得的陽性血清和陰性血清。8.酶標儀、洗板機。試劑與器材操作步驟編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板設(shè)陰性對照2孔、陽性對照3孔，空白對照2孔加樣：分別在相應(yīng)孔加入待檢標本、陰性、陽性對照100μl，用封板膜封板后置37℃溫育60min。洗滌：用洗板機清洗，在干凈濾紙上拍干。加酶：每孔加酶結(jié)合物100μl（空白對照孔除外），充分混勻，置37℃溫育30min。洗滌：用洗板機清洗，在干凈濾紙上拍干。顯色：每孔加入底物緩沖液50μl，TMB50μl，振蕩混勻，37℃避光顯色10min。測定：每孔加終止液50μl，振蕩混勻。在450nm波長下，酶標儀測定各孔A450nm值。結(jié)果判斷計算臨界值：臨界值=陽性對照值×10%。正常情況下，陽性對照孔的A450nm值≥0.80，樣品A450nm值≥臨界值者為HIV抗體陽性。正常情況下，陰性對照孔的A450nm值≤0.08，樣品A450nm值＜臨界值者為HIV抗體陰性。注意事項實驗中設(shè)立陽性與陰性對照。底物顯色時間不宜過長。注意生物安全。對初篩呈陽性反應(yīng)的樣品，應(yīng)進行復(fù)檢試驗。如復(fù)檢均呈陰性，則報告HIV抗體陰性（-）；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，應(yīng)送HIV確證實驗室進行確證試驗。臨床意義作為HIV感染的篩查實驗。HIV有兩個血清型：HIV-1和HIV-2，后者少見。此試驗陽性者應(yīng)進一步作確證試驗。思考題ELISA是檢測HIV抗體的常用方法，但并不是唯一的方法。化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗、免疫膠體金以及免疫層析實驗等均可用于HIV抗體的檢測，試比較各種方法之間的優(yōu)缺點。第三軍醫(yī)大學(xué)吳超

實驗二HIV確認實驗HIV抗體初篩試驗陽性者，須作確證試驗。確證實驗必須在專門的艾滋病確證實驗室中進行，并最終確定患者是否感染HIV。確證試驗方法包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗、免疫熒光試驗等。免疫印跡實驗(WesternBlot，WB)是用以檢測HIV抗體的首選確證試驗方法，其檢測結(jié)果常常被作為鑒別其他檢驗方法優(yōu)劣的“金標準”。以硝酸纖維素膜為載體的抗原條，組合了HIV-1全病毒抗原和HIV-2gp36重組蛋白抗原。當(dāng)抗原條與被檢血清及對照血清接觸時，如血清標本有HIV-1/HIV-2特異性抗體，將會與抗原條上的HIV-1/HIV-2gp36抗原結(jié)合。結(jié)合的抗體再與酶標二抗結(jié)合，加入底物顯色，觀察結(jié)果判斷。實驗原理1.HIV1/2抗原硝酸纖維膜條

20條2.印跡緩沖液（10×）

12ml3.漂洗緩沖液（10×）

60ml4.底物BCIP/NBT溶液

50ml5.結(jié)合物

70μl6.HIV1/2陰性對照血清

70μl7.HIV1弱陽性對照血清

70μl8.HIV1強陽性對照血清

70μl9.反應(yīng)槽、搖床、移液管、吸引器試劑與器材操作步驟取出反應(yīng)槽，每一槽內(nèi)加2ml漂洗緩沖液。用鑷子小心地夾住抗原條編號端放入漂洗緩沖液中，編號面朝上，每槽1條，讓溶液完全覆蓋。將反應(yīng)槽放置搖床，搖動5～10分鐘后吸棄漂洗液。每槽加入印跡緩沖液2ml，然后分別加入20μl待檢血清或血漿，并用本試劑盒中的對照血清作平行對照。在室溫下將反應(yīng)槽在搖床上搖動60分鐘。旋搖完畢后，吸棄印跡緩沖液。每槽加入2ml漂洗緩沖液，旋搖5分鐘后，吸棄漂洗緩沖液，共漂洗3次，每次5分鐘。在每槽中加入2ml結(jié)合物稀釋液，旋搖45分鐘。從槽中吸棄結(jié)合物稀釋液，重復(fù)步驟6。每槽中加入底物2ml，旋搖15分鐘。吸去底物液，每槽中加入2ml蒸餾水，旋搖5分鐘后，終止反應(yīng)。將抗原條放于二張濾紙間吸干水分后觀察結(jié)果。結(jié)果判斷1.對照血清檢測結(jié)果判定要求①HIV-1強陽性對照血清：必需出現(xiàn)gp160/gp120和gp41、p24帶型，以及p66、p55/p51、p34、p17帶型判定為陽性，HIV-2gp36應(yīng)為陰性。②HIV-1弱陽性對照血清：在gp160、gp120和gp41、p24帶型中至少出現(xiàn)二條，判定為陽性。其他位置其可能出現(xiàn)弱帶，但對分析并非必需。HIV-2gp36應(yīng)為陰性。③HIV-2陽性對照血清：必需出現(xiàn)gp36重組蛋白帶型。④陰性對照血清：應(yīng)無上述的特異性帶型出現(xiàn)。2.被檢血清/血漿的判定標準有下列情況之一者判定為HIV-1抗體陽性。①至少一條env帶和一條pol帶；②至少一條env帶和一條gag帶；③至少一條env帶、一條gag帶和一條pol帶；④至少二條env帶；有HIV-2gp36重組蛋白帶型出現(xiàn)者判定為HIV-2抗體陽性，需用HIV－2確認試劑進一步檢測。無HIV抗體特異性帶型出現(xiàn)者判定為HIV抗體陰性。出現(xiàn)HIV特異性抗體帶型，但帶型不足以確認陽性者，判定為HIV抗體可疑。注意事項實驗中必須同時設(shè)定HIV-1強陽性、HIV-1弱陽性和HIV-1+2陰性血清對照。如果抗原條和血清樣品作用時間過長，陰性樣品也可能出現(xiàn)弱帶。凡溶血、脂血或混濁樣品均為不宜檢測標本。試驗中操作應(yīng)注意生物安全。底物顯色時間，一般控制在30分鐘內(nèi)。時間太長，本底變深；如果強陽性血清色帶增深時可提前終止反應(yīng)；若弱陽性對照血清色帶較淺，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時間。臨床意義

用于在初篩試劑判斷為HIV陽性(如ELISA法)基礎(chǔ)上的血清或血漿樣本，進行確證是否為HIV-1陽性及診斷是否感染了HIV-2。

思考題HIV血清抗體檢測的初篩實驗和確認實驗在檢測HIV感染的臨床意義及實驗原理上的差異？免疫印記實驗、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗及免疫熒光試驗（IFA）等均可用作HIV的確認實驗，試分析免疫印記實驗應(yīng)用如此廣泛的原因?第三軍醫(yī)大學(xué)吳超實驗三T細胞亞群的流式細胞儀檢測HIV感染可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)中CD4+T細胞數(shù)量減少以及CD4+T細胞/CD8+T細胞比例失調(diào)，因此，CD4+T細胞計數(shù)可用于評價HIV感染者免疫狀況，輔助臨床進行疾病分期。CD4+T淋巴細胞數(shù)量還可評估HIV感染者機會性感染的風(fēng)險，輔助判斷是否進行預(yù)防性治療。背景知識CD4+和CD8+T淋巴細胞計數(shù)的方法分為兩大類，一類是應(yīng)用流式細胞儀測定法，另一類是非流式細胞儀測定法。其中，流式細胞儀檢測是目前應(yīng)用較為普遍的一種方法，包括多平臺法和單平臺法。單平臺法僅需要流式細胞儀進行群體細胞的相對計數(shù)。本實驗主要介紹單平臺法對T淋巴細胞的流式細胞檢測。流式細胞儀可檢測單細胞或微粒的信號，將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室，待測細胞在鞘液的包裹下單行排列，依次通過流式細胞儀的檢測區(qū)域。單平臺方法即應(yīng)用三色、四色流式試劑配以內(nèi)參絕對計數(shù)微球，加上流式細胞儀淋巴細胞亞群獲取和分析軟件，一步即可獲得T細胞亞群的相對數(shù)（百分比）和絕對數(shù)。通過使用已知數(shù)量的參考微球為內(nèi)參，可通過獲取的目標細胞與參考微球的比例、參考微球數(shù)量和樣品體積，得到每微升的淋巴細胞數(shù)量。實驗原理TruCOUNT絕對計數(shù)管。TriTEST三色試劑CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP或MultiTEST四色試劑CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC。FACSLysingSolution（10X）蒸餾水（0.45μm過濾）配制成1X濃度的溶血素；PBS鞘液0.45μm過濾；BDCaliBRITEBeads及BDTruCOUNTcontrols。流式細胞儀。試劑與器材操作步驟1.標本制備：采集外周靜脈血2-3ml,EDTA-K3抗凝。標本與試劑用前輕輕搖勻；2.準確加入20μl熒光試劑和50μl全血，充分混勻；3.充分混勻，室溫（20～25℃）避光反應(yīng)15min；4.加入450μlFACS溶血液(1X)，充分混勻；5.充分混勻，室溫（20～25℃）避光放置15min；6.24h內(nèi)流式檢測。單平臺一步法由計算機軟件直接出結(jié)果并打印出報告單，報告單的內(nèi)容包括如下：項目單位參考正常值范圍CD3+/CD45+%56%～85%CD3+絕對數(shù)個/μl1027～2086CD3++CD8+/CD45+%15%～34%CD3++CD8+絕對數(shù)個/μl323～836CD3++CD4+/CD45+%30%～54%CD3++CD4+絕對數(shù)個/μl706～1125CD4+/CD8+比值1～2結(jié)果判斷注意事項用于流式細胞儀免疫表型檢測的抗凝劑K2EDTA、K3EDTA、酸性枸櫞酸葡萄糖溶液（ACD）或肝素抗凝一般要求48h內(nèi)染色，染色后6h內(nèi)分析。如采血后24h內(nèi)染色，則可在染色后24h內(nèi)分析。在室溫（18～25℃）保存和運輸樣品，避免極端溫度（結(jié)冰或大于37℃）。高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中。溶血、凝血或結(jié)冰的樣品應(yīng)視為不合格樣品，超過檢測允許時間的樣品不可檢測。應(yīng)報告所有相關(guān)數(shù)據(jù)的正常值范圍，且每個實驗室都應(yīng)測定參考數(shù)值。臨床意義①用于HIV感染者的疾病分期：凡CD4+T淋巴細胞＜200/μl或CD4+T淋巴細胞的百分比＜14%的HIV感染者可歸入艾滋病。②判斷HIV感染的臨床合并癥：如CD4+T淋巴