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文檔簡介

食品衛(wèi)生微生物檢驗實驗室操作要求食品微生物實驗室工作人員,必須有嚴格的無菌觀念,許多試驗要求在無菌條件下進行,主要原因:一是防止試驗操作中人為污染樣品;二是保證工作人員安全,防止檢出的致病菌由于操作不當造成個人污染。一.無菌操作要求1.接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。2.進行接種食品樣品時,必須穿專用的工作服、帽及拖鞋,應放在無菌室緩沖間,工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。3.接種食品樣品時,應在進無菌室前用肥皂洗手,然后用75%酒精棉球?qū)⑹植粮蓛簟?.進行接種所用的吸管,平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌,打開包裝未使用完的器皿,不能放置后再使用,金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。5.從包裝中取出吸管時,吸管尖部不能觸及外露部位,使用吸管接種于試管或平皿時,吸管尖不得觸及試管或平皿邊。6.接種樣品、轉(zhuǎn)種細菌必須在酒精燈前操作,接種細菌或樣品時,吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒。7.接種環(huán)和針在接種細菌前應經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲,必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處,接種結核菌和烈性菌的接種環(huán)應在沸水中煮沸5min,再經(jīng)火焰燒灼。8.吸管吸取菌液或樣品時,應用相應的橡皮頭吸取,不得直接用口吸。二.無菌間使用要求1.無菌間通向外面的窗戶應為雙層玻璃,并要密封,不得隨意打開并設有與無菌間大小相應的緩沖間及推拉門,另設有0.5-0.7m2的小窗,以備進入無菌間后傳遞物品。2.無菌間內(nèi)應保持清潔,工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒,擦拭工作臺面,不得存放與實驗無關的物品。3.無菌間使用前后應將門關緊,打開紫外燈,如采用室內(nèi)懸吊紫外燈消毒時,需30W紫外燈,距離在1.0m處,照射時間不少于30min,使用紫外燈,應注意不得直接在紫外線下操作,以免引起損傷,燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭,除去上面灰塵和油垢,以減少紫外線穿透的影響。4.處理和接種食品標本時,進入無菌間操作,不得隨意出入,如需要傳遞物品,可通過小窗傳遞。5.在無菌間內(nèi)如需要安裝空調(diào)時,則應有過濾裝置。三.消毒滅菌要求微生物檢測用的玻璃器皿、金屬用具及培養(yǎng)基、被污染和接種的培養(yǎng)物等,必須經(jīng)滅菌后方能使用。(一)干熱和濕熱高壓蒸氣鍋滅菌方法1.滅菌前準備(1)所有需要滅菌的物品首先應清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用紙包裝嚴密,如用金屬筒應將上面通氣孔打開。(2)裝培養(yǎng)基的三角瓶塞,用紙包好,試管蓋好蓋,注射器須將管芯抽出,用紗布包好。2.裝放(1)干熱滅菌器:裝放物品不可過擠,且不能接觸箱的四壁。(2)大型高壓蒸氣鍋:放置滅菌物品分別包扎好,直接放入消毒筒內(nèi),物品之間不能過擠。3.設備檢查(1)檢查門的開關是否靈活,橡皮圈有無損壞,是否平整。(2)檢查壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位,關好門和蓋,通蒸氣或加熱后,觀察是否漏氣,壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合,管道有無堵塞。(3)對有自動電子程序控制裝置的滅菌器,使用前應檢查規(guī)定的程序,是否符合于進行滅菌處理的要求。4.滅菌處理(1)干熱滅菌法:此法適應于在干熱情況下,不損壞、不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品、較常用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。①器械器皿應清洗后再干烤,以防附著在表面的污物炭化。②滅菌時安放物品不能過擠,不要直接接觸底和箱壁,物品之間留有空隙。③菌時將箱門關緊,接上電源,先將排氣孔打開約30min,排除滅菌器中的冷空氣,溫度升至160℃調(diào)節(jié)指示燈,維持1.5?2h。④滅菌完畢后或溫度升溫過程中,須在60℃以下才能打開箱門。(2)手提式高壓鍋或立式壓力蒸氣滅菌器的使用應按下列步驟進行:①手提式高壓鍋在主體內(nèi)加入3L清水,立式高壓鍋加水16L(重復使用時應將水量補足,水變混濁需更換);②手提式壓力鍋將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中(無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用);③蓋好頂蓋擰緊,勿使漏氣;置滅菌器于火源上加熱,立式壓力鍋通上電源,并打開頂蓋上的排氣閥放了冷氣(水沸騰后排氣10-15min);④關閉排氣閥,使蒸氣壓上升到規(guī)定要求,并維持規(guī)定時間(按滅菌物品性質(zhì)與有關情況而定);⑤達到規(guī)定時間后,對需干燥的物品,立即打開排氣閥排出蒸氣,待壓力恢復到零時,自然冷卻至60℃后開蓋取物,如為液體物品,不要打開排氣閥,而應立即將鍋去除熱源,待自然冷卻,壓力恢復至零,溫度降到60℃以下再開蓋取物,以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破;(3)臥式壓力鍋蒸氣滅菌器的使用按下列步驟進行:①關緊鍋門,打開進氣閥,將蒸氣引入夾層進行預熱,夾層內(nèi)冷空氣經(jīng)阻氣器自動排出。②夾層達到預定溫度后,打開鍋室進氣閥,將蒸氣引入鍋室,鍋室內(nèi)冷空氣經(jīng)鍋室阻氣器自動排出。③待鍋室達到規(guī)定的壓力與溫度時,調(diào)節(jié)進氣閥,使保持恒定④自然或人工降溫至60℃再開門取物,不得使用快速排出蒸氣法,以防突然降壓,液體劇烈沸騰或容器爆破。⑤使用自動程序控制式壓力蒸氣滅菌器,在放好物品關緊門后,應根據(jù)物品類別按動相應開關,以便按要求程序自動進行滅菌,滅菌時必須利用附設儀表記錄溫度與時間以備查,操作要求應嚴格按照廠家說明書進行。5.滅菌溫度與時間(1)干熱滅菌器滅菌溫度160℃,1.5-2h。(2)壓力蒸氣滅菌鍋滅菌溫度與時間(二)間歇滅菌方法1.滅菌方法系:利用不加壓力的蒸氣滅菌,某些物質(zhì)經(jīng)高壓蒸氣滅菌容易破壞,可用此法滅菌。(1)將欲滅菌物品置于鍋內(nèi),蓋上頂蓋,打開排水口,使器內(nèi)余水排盡。(2)關閉排水口,打開進氣門,根據(jù)需要消毒10~20min。(3)滅菌完畢關閉進氣門,取出物品待冷至室溫溫度,放入37℃溫箱過夜,次日仍按上述方法消毒,如此三次,即可達到滅菌目的。2.血清凝固器使用方法:培養(yǎng)基中含有血清或雞蛋特殊成份時,因高熱會破壞其營養(yǎng)成份,故用低溫,可使血清凝固,又可達到滅菌目的:(1)在使用該法滅菌的血清等分裝時,需嚴格遵守無菌操作,試管、平皿也經(jīng)滅菌后使用。(2)將培養(yǎng)基按要求使成斜面或高層,加足水后,接上電源,升溫75~90℃1h滅菌,放37℃溫箱過夜,再如此滅菌三次。3.煮沸消毒:可用煮鍋或煮沸消毒器,水沸騰后再煮5~15min,也可在水中加入2%石炭酸煮沸5min,加入0.02%甲醛,80℃煮60min均可達到滅菌目的,但選用煮沸消毒的增消劑時,應注意對物品的腐蝕性。4.滅菌處理:滅菌后物品,按正常情況已屬無菌,從滅菌器中取出應仔細檢查放置,以免再度污染;(1)物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉,不可作為無菌物品使用;(2)取出的物品,如為包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用;(3)培養(yǎng)基或試劑等,應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達到者應廢棄;(4)啟閉式容器,在取出時應將篩孔關閉;(5)取出的物品掉落在地或誤放不潔這處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用;(6)取出的合格滅菌物品,應存放于貯藏室或防塵柜內(nèi),嚴禁與未滅菌物品混放;(7)凡屬合格物品,應標有滅菌日期及有效期限;(8)每批滅菌處理完成后,記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。四.有毒有菌污物處理要求微生物實驗所用實驗器材、培養(yǎng)物等未經(jīng)消毒處理,一律不得帶出實驗室。1.經(jīng)培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內(nèi),并集中存放在指定地點,待統(tǒng)一進行高壓滅菌。2.經(jīng)微生物污染的培養(yǎng)物,必須經(jīng)121℃,30min高壓滅菌。3.染菌后的吸管,使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸液中,最少浸泡24h(消毒液體不得低于浸泡的高度)再經(jīng)121℃,30min高壓滅菌。4.涂片染色沖洗片的液體,一般可直接沖入下水道,烈性菌的沖洗液必須沖在燒杯中,經(jīng)高壓滅菌后方可倒入下水道,染色的玻片放入5%煤酚皂溶液中浸泡24h后,煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿,必須高壓滅菌后洗滌。5.打碎的培養(yǎng)物,立即用5%煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位,浸泡半小時后再擦拭干凈。污染的工作服或進行烈性試驗所穿的工作服、帽、口罩等,應放入專用消毒袋內(nèi),經(jīng)高壓滅菌后方能洗滌。五.培養(yǎng)基制備要求培養(yǎng)基制備的質(zhì)量將直接影響微生物生長。因為各種微生物對其營養(yǎng)要求不完全相同,培養(yǎng)目的的不同,各種培養(yǎng)基制備要求如下:1.根據(jù)培養(yǎng)基配方的成分按量稱取,然后溶于蒸餾水中,在使用前對應用的試劑藥品應進行質(zhì)量檢驗。2.pH測定及調(diào)節(jié):pH測定要在培養(yǎng)基冷至室溫時進行,因在熱或冷的情況下,其pH有一定差異,當測定好時,按計算量加入堿或酸混勻后,應再測試一次。培養(yǎng)基pH值一定要準確,否則會影響微生物的生長或影響結果的觀察。但需注意因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高,故不宜滅菌壓力過高或次數(shù)太多,以免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量,指示劑、去氧膽酸鈉、瓊脂等一般在調(diào)完pH后再加入。3.培養(yǎng)基需保持澄清,便于觀察細菌的生長情況,培養(yǎng)基加熱煮沸后,可用脫脂棉花或絨布過濾,以除去沉淀物,必要時可用雞蛋白澄清處理,所用瓊脂條要預先洗凈晾干后使用,避免因瓊脂含雜質(zhì)而影響透明度。4.盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器,使用洗凈的中性硬質(zhì)玻璃容器為好。5.培養(yǎng)基的滅菌既要達到完全滅菌目的,又要注意不因加熱而降低其營養(yǎng)價值,一般121℃,15min即可,如為含有不耐高熱物質(zhì)的培養(yǎng)基如糖類、血清、明膠等,則應采用低溫滅菌或間歇法滅菌,一些不能加熱的試劑如亞碲酸鉀、卵黃、TTC、抗菌素等,待基礎瓊脂高壓滅菌后涼至50℃左右再加入;6.每批培養(yǎng)基制備好后,應做無菌生長試驗及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養(yǎng)基,使用標準菌株接種培養(yǎng),觀察生化反應結果,應呈正常反應,培養(yǎng)基不應貯存過久,必要時可置4℃冰箱存放。7.目前,各種干燥培養(yǎng)基較多,每批需用標準菌株進行生長試驗或生化反應觀察,各種培養(yǎng)基用相應菌株生長試驗良好后方可應用,新購進的或存放過久的干燥培養(yǎng)基,在配制時也應測PH,使用時需根據(jù)產(chǎn)品說明書用量和方法進行。8.每批制備的培養(yǎng)基所用化學試劑、滅菌情況及菌株生長試驗結果、制作人員等應做好記錄,以備查詢。六.樣品采集及處理要求1.所采集的檢驗樣品一定要具有代表性,采樣時應首先對該批食品原料、加工、運輸、貯藏方法條件、周圍環(huán)境衛(wèi)生狀況等進行詳細調(diào)查,檢查是否有污染源存在。2.根據(jù)食品的種類及數(shù)量,采樣數(shù)量及方法應按標準檢驗方法的要求進行。3.采樣應注意無菌操作,容器必須滅菌,避免環(huán)境中微生物污染,容器不得使用煤酚皂溶液,用新潔爾滅、酒精等消毒藥物滅菌,更不能含有此類消毒藥物或抗生素類藥物,以避免殺死樣品中的微生物,所用剪、刀、匙用具也需滅菌方可應用。4.樣品采集后應立即送往檢驗室進行檢驗,送檢過程中一般不超過3h,如,路程較遠,可保存在1~5℃環(huán)境中,如需冷凍者,則在凍存狀態(tài)下送檢。5.檢驗室收到樣品后,進行登記(樣品名稱、送檢單位、數(shù)量、日期、編號等),觀察樣品的外觀,如果發(fā)現(xiàn)有下列情況之一者,可拒絕檢驗:(1)樣品經(jīng)過特殊高壓、煮沸或其他方法殺菌者,失去代表原食品檢驗意義者;(2)瓶、袋裝食品已啟開者,熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者,即失去原食品形狀者(食物中毒樣品除外);(3)按規(guī)定采樣數(shù)量不足者;對送檢符合要求的樣品,檢驗室收到后,應立即進行檢驗,如果條件不具備,應置4℃冰箱存放,及時準備創(chuàng)造條件,然后進行檢驗。6.樣品檢驗時,根據(jù)其不同性狀,進行適當處理。(1)液體樣品接種時,應充分混合均勻,按量吸取進行接種。(2)固體樣品,用

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