蛋白質(zhì)化學(xué)中的層析技術(shù)

第四章

蛋白質(zhì)化學(xué)中的層析技術(shù)

層析法也稱色譜法(chromatography)，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”。

1941年，英國(guó)生物學(xué)家Martin和Synge首先提出了色譜塔板理論，為后來各種色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。第一節(jié)層析概述第二節(jié)離子交換層析第三節(jié)親和層析第四節(jié)凝膠過濾第五節(jié)疏水層析第六節(jié)分配層析第七節(jié)吸附層析第一節(jié)層析概述

一、層析的原理

層析技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對(duì)比）不同，而且隨流動(dòng)相向前移動(dòng)，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配，從而達(dá)到將各組份分離的目的。

二、層析的分類

按固定相基質(zhì)的形式：柱層析、紙層析和薄層層析

根據(jù)流動(dòng)相的形式：液相層析、氣相層析

凝膠過濾原理吸附層析疏水層析分配層析親和層析離子交換三、層析前蛋白質(zhì)處理

主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。1、鹽析法鹽離子與水分子作用，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，暴露出來的蛋白質(zhì)表面疏水性區(qū)域相互結(jié)合，形成沉淀。

2、等電點(diǎn)沉淀

在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子會(huì)破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。3、有機(jī)溶劑沉淀降低水溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)不同電荷之間的靜電引力，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀；有機(jī)溶劑與水作用使蛋白質(zhì)的表面水化層厚度壓縮，導(dǎo)致蛋白質(zhì)脫水，蛋白質(zhì)間的疏水作用增強(qiáng)，從而產(chǎn)生沉淀。四、層析基本操作過程

裝置選擇上樣和洗脫結(jié)果檢測(cè)

上樣均一性洗脫裝置目的不同檢測(cè)方法不同活性檢測(cè)基質(zhì)均勻性柱層析的L/d比值1、柱層析的L/d比值

2、洗脫裝置

不改變?nèi)軇w系依靠液面的水位差產(chǎn)生的靜壓力致使洗脫液不斷流經(jīng)層析柱缺點(diǎn)：隨著溶液的流去，水位差也逐漸減小，流速也在變小。改善：蠕動(dòng)泵或恒流泵維持流速恒定的簡(jiǎn)易裝置

改變?nèi)軇┫到y(tǒng)

分級(jí)洗脫在一個(gè)溶劑系統(tǒng)洗滌后，改用另一溶劑系統(tǒng)。缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)和層析基質(zhì)的結(jié)合強(qiáng)度相差并不很大，溶劑系統(tǒng)的改變又不可能過細(xì)過密同一個(gè)洗脫級(jí)分中就可能含有兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)，達(dá)不到分離純化的目的。遞減遞增pH陰離子交換樹脂陽離子交換樹脂離子強(qiáng)度疏水層析離子交換層析

改變?nèi)軇┫到y(tǒng)

梯度洗脫

一種溶液以恒定的速度連續(xù)地進(jìn)入處于溫和攪拌的盛有另一種溶液的容器中，經(jīng)混合后的液體以同速度沉入層析柱作為洗脫液，在這樣所得到的洗脫液中一種溶液的濃度以線性梯度方式連續(xù)地發(fā)生改變。注意：梯度洗脫呈現(xiàn)一個(gè)峰，但有可能存在兩個(gè)性質(zhì)接近的蛋白質(zhì)。線性梯度洗脫裝置性能未知樣品的蛋白質(zhì)分離：改變緩慢的梯度洗脫→若為單峰：分級(jí)洗脫3、結(jié)果檢測(cè)活性檢測(cè)

比活沒有提高

目的蛋白與雜蛋白并沒有分開

比活有所提高，但總活性回收很低

目的蛋白有損失或有失活現(xiàn)象測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可不考慮目的蛋白的生物活性結(jié)果保存薄層層析&紙層析照相保存or掃描儀轉(zhuǎn)為圖形or積分儀變成數(shù)據(jù)柱層析檢測(cè)器、記錄儀和積分儀處理4、層析裝置的儀器化HPLC與微機(jī)、質(zhì)譜等連用第二節(jié)離子交換層析

一、原理

離子交換層析技術(shù)是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動(dòng)相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項(xiàng)技術(shù)。

原理：利用物質(zhì)的電荷和層析載體的電荷間的相互作用，進(jìn)而達(dá)到分離純化的目的。

高分子聚合物基質(zhì)、配基和平衡離子↙共價(jià)結(jié)合平衡離子平衡離子是結(jié)合于配基上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。陽離子交換劑：平衡離子帶正電的離子交換劑，能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用陰離子交換劑：平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑，與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用

pH值的影響

NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlost離子溶度影響

→離子濃度增加

+離子取代順序離子交換劑的基質(zhì)

瓊脂糖離子交換劑

離子交換交聯(lián)葡聚糖聚苯乙烯離子交換纖維素

1、離子交換纖維素交換劑名

稱（纖維素）作用基團(tuán)特

點(diǎn)陰離子交換劑二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2H4-NH2胍乙基強(qiáng)堿性、極高pH仍有效陽離子交換劑羧甲基CM—-O-CH2-COO—最常用在pH4以上磷酸P－-O-PO2－用于低pH磺甲基SM－-O-CH2-SO3－磺乙基SE－-O-C2H4-SO3－強(qiáng)酸性用于極低pH

常用：DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）CM-纖維素（羧甲基纖維素）開放性長(zhǎng)鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實(shí)際交換容量要比離子交換樹脂大的多。親水性，對(duì)蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達(dá)到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。

回收率高優(yōu)點(diǎn)：

2、交聯(lián)葡聚糖類

型性

能離子基因反離子總交換容量（毫克當(dāng)量/g）DEAE-sephadexA-25弱堿性、陰離子交換劑DEAE+Cl—3.5±0.5DEAE-sephadexA-50QAE-sephadex-25弱堿性、陰離子交換劑QAE+Cl—3.0±0.4QAE-sephadexA-50CM-A-sephadex25弱堿性、陽離子交換劑CM—Na+4.5±0.5CM-sephadexA-50SP-sephadexA-25強(qiáng)堿性、陽離子交換劑SP—Na+2.3±0.3SP-sephadexA-50

優(yōu)點(diǎn)：不會(huì)引起被分離物質(zhì)的變性或失活非特異性吸附少交換容量大

離子交換葡聚糖的選用：

一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定中等分子量（30000-200000）一般選A50和C50低分子量（＜30000）和高分子量（＞200000）均宜選用A25和C25。3、瓊脂糖離子交換劑

交換劑名

稱特點(diǎn)陰離子交換劑DEE-SepharouseCL-6B弱堿性pH:2-14DEAE-SepharouseFastFLowQ-SepharouseFF陽離子交換劑CM-SepharouseCL-6B弱酸性pH:2-14優(yōu)點(diǎn)：對(duì)pH及溫度的變化均較穩(wěn)定，可在pH3～10和0～70℃范圍內(nèi)使用改變離子強(qiáng)度或pH時(shí)，床體積變化不大流速快，分辨率高特別適用于相對(duì)分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)和核酸等化合物的分離。

4、聚苯乙烯陰離子交換劑

AmberliteIRA&Dowexl

eg.Dowexl×4-100陽離子交換劑

AmberliteIRC&Dowex50強(qiáng)陰離子交換劑交聯(lián)度為4%顆粒度為50-100目5、其他聚乙烯醇

DEAE-Toyopearl&CM-Toyopearl

富羥基

高親水性兼性離子交換劑基質(zhì)上連有β-丙氨酸、對(duì)氨基苯磺酸、精氨酸等偶極離子

or凝膠網(wǎng)孔中包含陰、陽離子的磷脂的脂質(zhì)體

三、離子交換介質(zhì)的配基提供了可交換的離子，是由帶電荷的官能團(tuán)組成通過或長(zhǎng)或短的碳?xì)滏溄?jīng)醚鍵結(jié)合到聚合物骨架上，相應(yīng)的分別得到了陽離子和陰離子交換劑

配基結(jié)構(gòu)pK分類簡(jiǎn)稱硫酸基(sulphate)-OSO3H<2強(qiáng)酸S磺酸基(sulphonate)-(CH2)nSO3H<2強(qiáng)酸SM(n=1)，SE(n=2)，SP(n=3)，SB(n=4)磷酸基(phosphate)-OPO3H2<2和6中等酸性P羧酸基(carboxylate)-(CH2)nCOOH3.5-4.2弱酸CM(n=1)叔胺基(tertiaryamine)2(CH2)nN+H(C2H5)28.15-9.15弱堿DEAE(n=2)季胺基(quaternaryamine)2(CH2)n-2N+≡(R)3>9強(qiáng)堿Q，QAE

pK值決定了相應(yīng)的離子交換劑的pH工作范圍密度在配基密度達(dá)到一個(gè)極限值之前，蛋白質(zhì)的吸附容量和保留值隨著配基密度的增加而明顯增加；過了極限值，蛋白質(zhì)的吸附容量和保留值隨配基密度的增加基本上沒有影響。種類一般對(duì)同類型的離子交換劑來說，強(qiáng)陽(陰)離子交換劑比弱陽(陰)離子交換劑對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合能力強(qiáng)，需較強(qiáng)的鹽濃度進(jìn)行洗脫，相對(duì)的選擇性較高

四、基本操作

緩沖液的選擇層析柱的選擇

洗脫流速↓↙加樣洗脫洗脫液的監(jiān)測(cè)收集及組分鑒定離子交換劑的清洗、再生和保存

↓↓↓←離子交換劑的處理

↘↑離子交換劑的選擇

1、離子交換劑的選擇配基的選擇取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負(fù)電，則選擇陰離子交換劑。一般分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。

基質(zhì)的選擇價(jià)格分辨率和穩(wěn)定性特點(diǎn)纖維素離子交換劑較低較低適于初步分離和大量制備葡聚糖離子交換劑適中適中受外界影響較大，體積可能隨離子強(qiáng)度和pH變化有較大改變，影響分辨率瓊脂糖離子交換劑較貴較高

顆粒大小

分辨率平衡時(shí)間流速應(yīng)用小顆粒高長(zhǎng)慢分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離大顆粒低短快需要高分辨率的分析或分離2、離子交換劑的處理酸堿浸泡進(jìn)一步去除雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子，一般陽離子交換劑最后用堿NaOH處理，陰離子交換劑最后用酸HCl處理。

膨化將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的配基充分暴露出來。水懸浮去除雜質(zhì)和細(xì)小顆粒3、緩沖液的選擇保證各個(gè)待分離物質(zhì)的穩(wěn)定；使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合，而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定；注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。離子強(qiáng)度和pH4、層析柱的選擇親和力相差不多而需要交換劑的體積較大增加柱長(zhǎng)為宜，使待分離的組分被洗脫后再結(jié)合于交換劑上的概率增加，柱的直徑與高度的比以1：20左右為宜。采用離子強(qiáng)度較大的梯度洗脫選用粗而短的柱子為宜。因?yàn)楫?dāng)柱上洗脫液的離子強(qiáng)度高到足以完全取代被吸附的離子時(shí)，這些被置換的離子則以同洗脫液等速率從柱上向下移動(dòng)，如果柱細(xì)長(zhǎng)，即從脫附到流出之間的距離長(zhǎng)，使脫附的離子擴(kuò)散的機(jī)會(huì)增加，結(jié)果造成分離峰過寬，降低分辨率。用交聯(lián)葡聚糖離子交換劑和纖維素離子交換劑時(shí)，常用的柱高為15～20cm。5、上樣樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達(dá)此目的。不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過濾前，以離心法除去。上樣量要適當(dāng)，不要超過柱的負(fù)荷能力，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。

第八次課6、洗脫改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度當(dāng)使用陰離子交換劑時(shí)，增加鹽離子濃度，則降低pH值。當(dāng)使用陽離子交換劑時(shí)，增加鹽離子濃度，則升高pH值

親和洗脫目的蛋白與加入離子發(fā)生特異性相互作用而被置換添加置換劑能置換基質(zhì)上所有蛋白質(zhì)洗脫方法階段洗脫和梯度洗脫

7、洗脫速度洗脫速度通常要保持恒定洗脫速度慢比快的分辨率好如果洗脫峰相對(duì)集中某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。8、洗脫液的監(jiān)測(cè)收集及組分鑒定監(jiān)測(cè)

用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行，在280nm處觀察洗脫液的光吸收收集

用分布收集器收集，可以自動(dòng)收集，也可以手動(dòng)收集鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳、測(cè)定活性等9、離子交換劑的清洗、再生和保存

可溶于堿的污染物

0.1mol/LNaOH洗滌Milli-Q純化的蒸餾水洗滌

結(jié)合緩沖液洗滌可以除去諸如脂類、蛋白質(zhì)和核酸這類的污染物。對(duì)于疏水性污染物乙醇溶液（如70%的乙醇）或非離子型的去污劑洗滌可以除去脂類和其他的疏水性物質(zhì)。→→金屬污染物

EDTA飽和的10mmol/LHCL（即pH=2）處理柱子沉淀物雜質(zhì)

去污劑、尿素和鹽酸胍，可將柱子在6mol/L

的尿素中平衡和溫育，然后用去離子水和緩沖液洗滌。

再生

對(duì)使用過的離子交換劑進(jìn)行處理，使其恢復(fù)原來性狀的過程。酸堿交替浸泡保存處理洗凈蛋白等雜質(zhì)后，加入適當(dāng)?shù)姆栏瘎?，一般加?.02%的疊氮鈉，4°C下保存。五、應(yīng)用實(shí)例陰離子交換層析

從人血漿中分離得到血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白G(IgG)

25mmol／L的乙酸鈉緩沖液充分透析血漿

用乙酸將血漿的pH調(diào)至5.2，除去沉淀

上陰離子交換柱

pH5.2的乙酸緩沖液洗脫等電點(diǎn)較高的IgG

pH為4.5的同樣濃度的同一緩沖液，以階段洗脫的方式得到HSA

降低pH至4.0，同時(shí)升高緩沖液的濃度至150mmol/L，洗脫得到其他的糖蛋白↓↓↓↓↓

用DEAE-SepharoseCL-6B柱大量分級(jí)人血漿蛋白

陽離子交換層析用CM纖維素分離雞蛋清中的蛋白質(zhì)組份

表雞蛋清中一些蛋白質(zhì)用CM纖維素分離結(jié)果的分析級(jí)分中的蛋白質(zhì)pI洗脫緩沖液的pH洗脫峰pH產(chǎn)量（mg）活性回收（%）A．?dāng)M卵粘蛋白3.9-4.34.34.342.287B．?dāng)M卵粘蛋白3.9-4.34.44.40.9C．卵蛋白A14.584.554.5173.889D．卵蛋白A24.654.754.6537.2E．卵蛋白A34.755.04.8511.0F．“球蛋白”5.55.23.6G．卵轉(zhuǎn)鐵蛋白6.5-6.86.05.842.587H．卵轉(zhuǎn)鐵蛋白6.5-6.86.76.116.1I．“球蛋白”8.58.07.5J．“球蛋白”9.59.32.4K．“球蛋白”10.09.41.1L．抗生物素蛋白>1010.09.50.939M．“球蛋白”10.09.91.2N．溶菌酶10.010.02.192第三節(jié)親和層析

一、原理親和力生物分子間存在很多特異性的相互作用，如抗原－抗體、酶－底物或抑制劑、激素－受體等，它們之間都能夠?qū)Ｒ欢赡娴慕Y(jié)合。分離原理通過將具有親和力的兩個(gè)分子中一個(gè)固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離純化。重組蛋白

用基因工程的方法引入特殊結(jié)合位點(diǎn)（如金屬結(jié)合位點(diǎn)），將其加在重組目的蛋白的氨基端或羧基端。緊鄰結(jié)合位點(diǎn)的位置加入蛋白酶切割位點(diǎn)，以便在用親和層析純化之后，將多余的蛋白質(zhì)片段去掉。

二、親和層析用基質(zhì)具有較好的物理化學(xué)穩(wěn)定性能夠和配體穩(wěn)定的結(jié)合結(jié)構(gòu)為均勻的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與樣品中的各個(gè)組分均沒有明顯的非特異性吸附

1、各類基質(zhì)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)纖維素價(jià)格低、活性基團(tuán)較多非特異性吸附強(qiáng)、穩(wěn)定性和均一性較差交聯(lián)葡聚糖穩(wěn)定性較好孔徑較小、穩(wěn)定性不好聚丙烯酰胺同上同上瓊脂糖非特異性吸附低、穩(wěn)定性好、孔徑均勻適當(dāng)、宜于活化多孔玻璃機(jī)械強(qiáng)度好，化學(xué)穩(wěn)定性好活性基團(tuán)較少、對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的吸附作用

2、基質(zhì)的活化溴化氰活化環(huán)氧乙烷基活化

指通過對(duì)基質(zhì)進(jìn)行一定的化學(xué)處理，使基質(zhì)表面上的一些化學(xué)基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐子诤吞囟ㄅ潴w結(jié)合的活性基團(tuán)。溴化氰活化

生成亞胺碳酸活性基團(tuán)，它可以和伯氨(NH2)反應(yīng)，主要生成異脲衍生物缺點(diǎn)：

非特異性吸附，影響親和層析的分辨率。與配體結(jié)合不夠穩(wěn)定溴化氰有劇毒、易揮發(fā)，操作不便。

環(huán)氧乙烷基活化

活化后的基質(zhì)都含有環(huán)氧乙烷基，可以結(jié)合含有伯氨基(NH2)、羥基(OH)和硫醇基(SH)等基團(tuán)的配體優(yōu)點(diǎn)

不引入電荷基團(tuán)，與配體形成的N－C、O－C和S－C

鍵都很穩(wěn)定，使用壽命長(zhǎng)

缺點(diǎn)與配體偶聯(lián)時(shí)需要堿性條件，溫度為20~40℃，對(duì)于一些比較敏感的配體可能不適用多種商品化的活化基質(zhì)

三、配體與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性與基質(zhì)穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性配體的分類特異性配體只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體

eg.抗原和抗體、酶和它的抑制劑

通用性配體特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體

eg.凝集素可以結(jié)合各種糖蛋白

配體待純化的蛋白質(zhì)配體待純化的蛋白質(zhì)抗原特定單克隆抗體或多克隆抗體肝素凝聚因子、脂酶、結(jié)締組織蛋白酶、DNA聚合酶單克隆抗體特定抗原膽固醇膽固醇受體、膽固醇結(jié)合蛋白蛋白質(zhì)A/蛋白質(zhì)G免疫球蛋白脂肪酸脂肪酸結(jié)合蛋白、白蛋白蛋白酶抑制劑蛋白酶核苷酸核苷酸結(jié)合蛋白、需核苷酸的酶磷酸磷酸酶苯基硼酸鹽糖蛋白三嗪染料脫氫酶、激酶、聚合酶、限制酶、干擾素凝集素糖蛋白抗生物素蛋白含生物素的酶糖凝集素、糖苷酶蛋白質(zhì)親和層析中的合適配體四、基本操作選擇適當(dāng)?shù)呐潴w將配體固定化到基質(zhì)上將目的蛋白混合液加樣到基質(zhì)上除去非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫純的目的蛋白1、上樣層析柱較短，通常10cm左右樣品液的濃度不宜過高上樣時(shí)流速比較慢樣品緩沖液中有一定的的離子強(qiáng)度上樣時(shí)選擇適當(dāng)較低的溫度2、洗脫特異性洗脫指利用洗脫液中的物質(zhì)與待分離物質(zhì)或與配體的親和特性而將待分離物質(zhì)從親和吸附劑上洗脫下來。

非特異性洗脫指通過改變洗脫緩沖液pH、離子強(qiáng)度、溫度等條件，降低待分離物質(zhì)與配體的親和力而將待分離物質(zhì)洗脫下來。

特異性洗脫

優(yōu)點(diǎn)：

特異性強(qiáng)，可以進(jìn)一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率?？杀苊獾鞍踪|(zhì)變性缺點(diǎn)：較常的時(shí)間、較大的洗脫條件。改善方法：選擇親和力強(qiáng)的物質(zhì)洗脫、加大洗脫液濃度

特異性洗脫非特異性洗脫與配體親和力較小

連續(xù)大體積平衡緩沖液沖洗，不影響活性，但洗脫體積較大，待分離物質(zhì)濃度較低。配體結(jié)合較強(qiáng)時(shí)

適當(dāng)?shù)膒H、離子強(qiáng)度洗脫，注意盡量不影響待分離物質(zhì)的活性與配體結(jié)合非常牢固時(shí)

使用較強(qiáng)的酸、堿或在洗脫液中加入脲、胍等變性劑，使蛋白質(zhì)等待分離物質(zhì)變性，洗脫后再?gòu)?fù)性3、吸附劑的再生和保存

再生

用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡嚴(yán)重的不可逆吸附時(shí)，使用高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑或加入適當(dāng)?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌副４?/p>

加入0.01%的疊氮化鈉，4°C

下保存五、親和層析用于蛋白質(zhì)分離的實(shí)例

免疫親和層析凝集素和糖蛋白親和層析含有輔酶的酶類的親和層析酶和蛋白類型抑制劑的親和層析肝素為配體的親和層析染料配體親和層析金屬螯合層析1、免疫親和層析

小鼠血清不同亞型IgG的分離1m1的A蛋白SepharoseCL-4B柱用1.5mol/L的甘氨酸-NaOH，pH8.9的緩沖液(內(nèi)含3mol／LNaCl)平衡

5m1小鼠血清同等體積的平衡液稀釋后上柱

洗去不吸附的蛋白質(zhì)

用不同pH的0.1mol/L檸檬酸洗脫

↓↓↓

2、凝集素和糖蛋白的親和層析分離

凝集素是在自然界廣泛存在的一大類糖結(jié)合蛋白。它們具有不同的糖結(jié)合專一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白，可以有效地分離純化不同型的凝集素，也可應(yīng)用固定化的凝集素分離純化各種糖蛋白。用10mmol/L的磷酸緩沖液(pH7.0，含0.15mol/LNaCl)平衡酸處理的Sepharose6B(AT-6B)

天花粉的丙酮粉制劑用平衡液抽提后，上AT-6B柱洗去不吸附的雜蛋白

用0.2mol/L的半乳糖溶液洗脫花粉凝集素↓↓↓ⅰ.用含有半乳糖的天然多糖-瓊脂糖的交聯(lián)產(chǎn)物分離天花粉凝集素

ⅱ.糖蛋白親和層析不同的糖蛋白具有不同的單相組分和糖鏈結(jié)構(gòu)，它們和不同的凝集素呈現(xiàn)出不同的結(jié)合能力。常用的凝集素：

ConA、LCA

對(duì)甘露糖專一

WGA對(duì)N-乙酰氨基葡萄糖專一人血色素結(jié)合蛋白(hemopexin)的分離

用50mmol/L的磷酸緩沖液，pH7.0(含0.2mol/LNaCl)平衡固定化的WGA柱離子交換層析得到含有血色素結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的級(jí)分上柱平衡液洗脫不結(jié)合在柱上的轉(zhuǎn)鐵蛋白含有100mg／m1N-乙酰氨基葡萄糖的平衡液洗脫血色素結(jié)合蛋白↘↙↓↓回收率達(dá)91％

豬淋巴細(xì)胞質(zhì)膜糖蛋白的分離1％的脫氧膽酸鈉增溶膜蛋白

上固定化的LCA柱(1cm×8cm)

用1％的脫氧膽酸鈉洗滌親和柱，除去雜蛋白用含2％α-甲基甘露糖苷的1％的脫氧膽酸鈉洗脫膜糖蛋白↓↓↓3、含有輔酶的酶類的親和層析

很多的酶中都含有不同類型的輔酶，最為常見的是氧化還原酶和脫氫酶含有NAD。為此用固定化的NAD可以分離不同類型的氧還酶和脫氫酶，或激酶

↓↓↓固定化NAD柱

4、酶和蛋白類型抑制劑的親和層析

一些酶及其抑制劑間存在著非常專一的相互作用。一些酶的抑制劑被固定化以后，就可用于一些酶的分離純化。一些固定化的酶也被應(yīng)用于蛋白類型的抑制劑的分離。為了避免位阻現(xiàn)象，在酶類的小分子抑制劑固定化時(shí)，常要插入一些不同長(zhǎng)度的“手臂”，如插入8-9個(gè)原子胰蛋白酶抑制劑的分離純化

部分純化的牛卵巢胰蛋白酶抑制劑溶于2mlpH4.0的乙酸緩沖液

流經(jīng)用同一緩沖液平衡的固定化胰蛋白酶柱

平衡液可洗去雜蛋白

用0.1mol／L的HCl，pH約1.2的溶液(內(nèi)含0.5mol／LNaCl和10mmol/LCaCl2)洗脫胰蛋白酶抑制劑

↓↓↓大腸桿菌EcoPl的分離

將大腸桿菌抽提液經(jīng)monoQ柱和固定化的肝素柱純化至80%純度上用特定序列(AGACC)的寡脫氧核苷酸和溴化氰活化的交聯(lián)瓊脂糖偶聯(lián)成的親和層析柱用10體積平衡液(10mmol/LTris-HCl，pH7.6，0.3mol/LNaCl，lmmol／LEDTA)充分洗滌用2體積的lmol/LKCl解析吸在親和柱上的EcoP1↓↓↓5、肝素為配體的親和層析

肝素是蛋白聚糖中的一種，可以和許多類型的蛋白質(zhì)結(jié)合。6、染料配體的層析

染料樹脂不專一的親和介質(zhì)優(yōu)點(diǎn)穩(wěn)定、和許多類型的酶結(jié)合，但又不被酶所作用、價(jià)格低廉

eg.Cibacron藍(lán)F3GA酵母中含有NAD酶的分離

面包酵母抽提液加入硫酸銨至75％飽和度，離心后，取220mg沉淀溶于10m1起始緩沖液流經(jīng)用起始緩沖液平衡的藍(lán)色交聯(lián)瓊脂搪凝膠CL-4B柱

pH8.6的緩沖液中加入10mmol/L的NAD+洗脫甘油醛-3-磷酸脫氫酶在起始緩沖液中加入5mmol/LNAD+洗脫醇脫氫酶在起始緩沖液中加入20mmolNADP+洗脫葡萄糖-6-磷酸脫氫酶洗脫液的pH升至8.6時(shí)，解析己激酶↓↓↓↓↓堿性磷酸單酯酶的分離

小牛小腸粘膜抽提液用DEAE離子交換纖維素除去部分雜蛋白酶活性的級(jí)分再上平衡的活性染料艷藍(lán)K-GRS和交聯(lián)瓊脂糖4B偶聯(lián)的染料層析柱平衡液洗除雜蛋白含有0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液可洗脫堿性磷酸單酯酶再吸附在活性染料Procion紅HE-33與交聯(lián)葡聚糖凝膠G-100偶聯(lián)的基質(zhì)柱上用含有0.1mol/L磷酸鹽的緩沖液對(duì)緩沖液梯度洗脫，酶活性出現(xiàn)在5mmol/L磷酸鹽濃度時(shí)↓↓↓↓↓回收率62％回收率96％

7、金屬螯合層析

基于蛋白質(zhì)的組氨酸咪唑基和半胱氨酸巰基能與銅、鋅、鎳離子間形成穩(wěn)定的螯合物而進(jìn)行分離的。人銅鋅超氧化物歧化酶的分離

酶純化34倍，活力回收92％酶純化2000倍，活力回收約58％人紅細(xì)胞濃縮裂解液上DEAE-CL-交聯(lián)瓊脂糖凝膠-6B柱

純化的酶液流經(jīng)固定化的亞氨基二乙酸柱

用20mmol/L乙酸緩沖液，pH5.0洗滌層析柱

用同樣濃度和同樣pH的檸檬酸緩沖液洗脫人銅鋅超氧化物歧化酶

↓↓↓人血漿中α2巨球蛋白(α2M)

的純化

人血漿經(jīng)硫酸銨分級(jí)后，取40％-55％的級(jí)分過Zn配位的固定化亞氨基二乙酸柱洗脫不吸附的蛋白質(zhì)用20mmol/L磷酸緩沖液，150mmol／LNaCl,pH5.0溶液洗脫α2M↓↓↓第四節(jié)凝膠過濾

凝膠層析又稱分子篩過濾、排阻層析等，依據(jù)是多孔的載體對(duì)不同體積和不同形狀分子的排阻能力的不同，從而對(duì)混合物進(jìn)行分離。優(yōu)點(diǎn)：凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，溫度范圍廣，不需要有機(jī)溶劑，分離效果好缺點(diǎn)：樣品被不斷稀釋，上樣量不能太大，否則分辨率變差一、原理

凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，小分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大分子則排阻于顆粒之外。大分子物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速率快，先被洗出層析柱小分子物質(zhì)可通過凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入顆粒內(nèi)部，然后再擴(kuò)散出來，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，最后被洗出層析柱1、體積參數(shù)分子在柱中移動(dòng)的速度取決于該分子在固定相和流動(dòng)相間的分配系數(shù)Kd，Kd表示某一分子在特定的凝膠柱內(nèi)的洗脫行為。Kd＝(Ve一Vo)／ViVe

洗脫體積Vo外水體積Vi內(nèi)水體積Ve=Vo該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，因而洗脫速度最快。即該成分的Kd＝0。Vi＝Ve-Vo該成分不被排阻而可完成進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,

因而洗脫速度最慢。即該成分的Kd=l。Kd值介于0-l之間，物質(zhì)的洗脫速度隨其Kd值的增加而降低一般物質(zhì)的Kd值是0<Kd<l。

洗脫行為可以有三種可能的情況:

凝膠Kd＝0Kd=l0<Kd<l2、影響分離效果的因素流速加樣體積樣品濃度離子強(qiáng)度①流速

影響洗脫液流速的因素洗脫液加在柱上的壓力

為保持層析過程中恒定的壓力，可使用恒壓瓶。凝膠交聯(lián)度凝膠顆粒大小

流速過低樣品橫向擴(kuò)散增大，峰變寬，分辨率降低，洗脫時(shí)間長(zhǎng)流速過高

洗脫峰重疊，柱壓增大，分離效果變差線性流速控制在2～10cm/h②加樣體積體積過大

平臺(tái)洗脫峰或相鄰峰重疊體積過小目的蛋白收集量少、稀釋倍數(shù)大、濃度低③樣品濃度進(jìn)樣前，樣品應(yīng)高度濃縮，濃度為10～20mg/ml分組分離&脫鹽除雜適當(dāng)提高樣品濃度分級(jí)分離&分析性實(shí)驗(yàn)濃度低④離子強(qiáng)度可防止蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間或與凝膠介質(zhì)之間的相互作用常用鹽溶液：

20-100mmol/LNaCl濃度過高引起凝膠柱床體積變化二、凝膠過濾層析的介質(zhì)

葡聚糖系列瓊脂糖系列聚丙烯酰胺系列多孔硅膠1、葡聚糖系列以微生物產(chǎn)生的葡聚糖Dextran為原料用環(huán)氧氯丙烷為交聯(lián)劑，在堿性條件下交聯(lián)而成商品的凝膠，稱為Sephadex先制成丙烯基的衍生物，然后再用N，N’-甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，得到商品化的凝膠，被稱為Sephacryl

2、瓊脂糖系列

較常用的是Pharmacia和BioRad兩家的產(chǎn)品，前者生產(chǎn)的稱為Sepharose，后者的產(chǎn)品為BioGelA。BioGelA系列的產(chǎn)品有不同的顆粒度，有粗、中和細(xì)三檔，它們的顆粒度分別為l50μm～300μm，80μm～150μm和40μm～80μm。

3、聚丙烯酰胺系列由丙烯酰胺單體和雙丙烯酰胺混合物聚合得到的多孔性物質(zhì)。產(chǎn)物也是固體粉末，用前先溶漲。

4、多孔硅膠優(yōu)點(diǎn)：

物理化學(xué)穩(wěn)定性高，耐熱耐壓，使用壽命長(zhǎng)缺點(diǎn)：

柱效較低、表面具有離子性，對(duì)蛋白質(zhì)有吸附性、不能在強(qiáng)堿性環(huán)境中使用剛性親水性填料，具有一定直徑的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球狀顆粒三、基本操作

凝膠的選擇凝膠柱的制備上樣洗脫凝膠柱的重復(fù)使用與保存1、凝膠的選擇

分組分離

根據(jù)樣品中的大分子和小分子分配系數(shù)上的顯著差異，將其分開?？蛇x用SephadexG-25和G-50

小肽和低分子量的物質(zhì)（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。分級(jí)分離

將樣品中一些分子量比較近似的物質(zhì)進(jìn)行分離。選用分級(jí)范圍較窄的凝膠，且中間值接近于目的蛋白的分子量

顆粒大小的影響優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)小顆粒分離效果好流速慢分離時(shí)間長(zhǎng)大顆粒流速快區(qū)帶擴(kuò)散洗脫峰平而寬2、凝膠柱的制備

用于分組分離

短而粗L/D值＜10

用于分級(jí)分離

L/D值比較大對(duì)很難分離的組分一般需要100cm左右長(zhǎng)的層析柱，其直徑在1～5cm范圍內(nèi)，小于1cm產(chǎn)生管壁效應(yīng)，大于5cm則稀釋現(xiàn)象嚴(yán)重。柱L/D值的選擇裝柱前，凝膠基質(zhì)用蒸餾水或洗脫液中充分溶脹。凝膠柱填裝后通?？梢圆捎靡环N有色的物質(zhì)，如藍(lán)色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，以檢測(cè)凝膠柱的均勻程度。3、上樣粘度因素粘度過大，分子因運(yùn)動(dòng)受限制，影響進(jìn)出凝膠孔隙，洗脫峰形寬而矮，有些可分離的組分因此重疊。分級(jí)分離

加樣體積約為凝膠柱床體積的1％～5％左右分組分離

加樣體積約為凝膠柱床體積的10％～25％

4、洗脫水

分離不帶電荷的中性物質(zhì)電解質(zhì)溶液（酸、堿、鹽的溶液）

分離帶電基團(tuán)的樣品水與有機(jī)溶劑的混合液（水-甲醇、水-乙醇、水-丙酮）

用于吸附較強(qiáng)的組分洗脫液5、凝膠柱的重復(fù)使用與保存當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可以加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存液相中保存：于凝膠懸液中加入防腐劑或高壓滅菌后

4℃保存。在半收縮狀態(tài)下保存：60%-70%酒精液洗沖，凝膠體積縮小干燥狀態(tài)保存：長(zhǎng)期不用，水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇四、凝膠層析的應(yīng)用

脫鹽分離提純測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量高分子溶液的濃縮蛋白質(zhì)復(fù)性研究1、脫鹽高分子溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、快速、蛋白質(zhì)和酶類等不易變性適用的凝膠：

SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6

用醋酸銨等揮發(fā)性鹽類緩沖液使層析柱平衡上樣用同樣緩沖液洗脫收集的洗脫液用冷凍干燥法除去揮發(fā)性鹽類蛋白質(zhì)不會(huì)因?yàn)槊擕}后溶解度降低會(huì)形成沉淀吸附于柱上

2、分離提純凝膠過濾的載體可以根據(jù)它們的孔徑分為很多種不同的規(guī)格。每種規(guī)格都有其特定的分級(jí)的范圍，一旦超出分組范圍，不論是其上限還是下限，即使分子量有大有小，但載體的排阻情況基本相同，就不能分離。在凝膠過濾層析時(shí)，要根據(jù)所要純化的樣品的分子量選擇所用的凝膠過濾的基質(zhì)。天花粉毒蛋白的凝膠過濾分離交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50柱(1.8cm×100cm)用50mmol/LTris-HCl,pH7.8緩沖液平衡天花粉硫酸銨糊(90％飽和度的沉淀)溶于2m1平衡緩沖液中上樣洗脫天花粉毒蛋白除去不溶物↓↘↘↓

3、測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量測(cè)大于所用載體上限分子的洗脫體積測(cè)小于下限的分子的洗脫體積標(biāo)定凝膠過濾柱的Vo標(biāo)定凝膠過濾柱的Vi測(cè)定一系列已知分子量的標(biāo)淮樣品在柱上的洗脫體積Ve以(Ve-Vi)／(Vo-Vi)和1ogMw作圖測(cè)得了待測(cè)分子量的樣品的Ve由(Ve-Vi)／(Vo-Vi)從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以求得未知樣品的分子量藍(lán)色葡聚糖氨基酸、有色鹽類↓↓↓↓↓↘↙以標(biāo)準(zhǔn)樣品的分子量的1ogMw對(duì)Ve作圖or

洗脫液中蛋白質(zhì)濃度4、高分子溶液的濃縮將SephadexG-25或50干膠投入到稀的高分子溶液中水分和低分子量的物質(zhì)就會(huì)進(jìn)入凝膠粒子內(nèi)部高分子物質(zhì)則排阻在凝膠顆粒之外離心或過濾，去除溶脹的凝膠濃縮的高分子溶液↓5、蛋白質(zhì)復(fù)性研究變性蛋白加入凝膠柱高濃度變性劑存在，蛋白呈無規(guī)則卷曲變性蛋白體積大，只能進(jìn)入顆粒間隙，遷移速度快變性劑分子量小，進(jìn)入顆粒內(nèi)部，遷移速度慢緩沖液洗脫蛋白變性劑濃度降低，轉(zhuǎn)成復(fù)性緩沖液變性蛋白復(fù)性，以天然形態(tài)洗脫出柱↓↓↓↓↓↓第九次課第五節(jié)疏水層析一、原理

疏水作用層析（HIC）是根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。

疏水性弱的物質(zhì)，在較高離子強(qiáng)度的溶液時(shí)被洗脫下來，當(dāng)離子強(qiáng)度降低時(shí)，疏水性強(qiáng)的物質(zhì)才隨后被洗脫下來。

WatermoleculesSoluteSurfaceexposedhydrophobicgroupsLigandWatermoleculesinbulk二、疏水配基

烷基鏈配基芳基配基

高分子配基

柱：HiPrep16/10

樣品:細(xì)胞色素C(1),溶菌酶（2），核糖核酸酶（3），靡蛋白酶原（4）三、疏水基質(zhì)人工合成聚合物類瓊脂糖纖維素聚苯乙烯聚丙烯酸甲酯類多糖類殼聚糖

應(yīng)用最廣泛

良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性

最常用：正辛基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠更強(qiáng)的疏水作用，一些疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)被吸附后不易解析苯基-交聯(lián)瓊脂糖凝膠

應(yīng)用于疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)

四、基本操作

平衡

Equilibration上樣

Sampleapplication洗雜Washing洗脫ElutionEquilibration1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionWatermoleculesHydrophobicligandGelmatrixSampleapplication1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionGelmatrixProteinsHydrophobicgroups

Washingoutunboundmaterial1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsNon-boundproteins1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionElutionTargetelutesConc.saltAbsElution1.Equilibration2.Sampleapplication3.Washing4.ElutionConc.saltAbsMorestronglyboundp